Page 27 - 《中国药房》2023年23期
P. 27
DWLL202108002）。 表1 小鼠和细胞 SREBP 靶基因检测的引物序列及扩
1.4 细胞 增产物大小
人肝癌细胞HepG2购自美国菌种保藏中心。 种属 基因 上游引物序列（5′→3′） 下游引物序列（5′→3′） 扩增产物大小/bp
小鼠 Srebp-1c GATGTGCGAACTGGACACAG CATAGGGGGCGTCAAACAG 104
2 方法
Acc1 CGCCAACAATGGTATTGCAGC TCGGATTGCACGTTCATTTCG 82
2.1 益肾通络方对db/db小鼠脂质代谢异常影响的体内 Fasn AGAGATCCCGAGACGCTTCT GCTTGGTCCTTTGAAGTCGAAGA 91
实验 Fads1 AGCACATGCCATACAACCATC TTTCCGCTGAACCACAAAATAGA 113
Scd5 TTCTTGCGATACACTCTGGTGC CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT 97
2.1.1 动物分组与给药 β-Actin GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 125
将 C57BLKS/J（db/db）小鼠按随机数字表法分为模 Srebp-2 GTTGACCACGCTGAAGACAGA CACCAGGGTTGGCACTTGAA 115
型组（后文统一为“db/db 组”，予生理盐水）和益肾通络 Dhcr24 ACCACTTCGTGGAAGGGTTG ACTGCCAATGCTATTCAGCTTG 104
Fdps GGGTTTGACCGTGGTACAAG AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC 113
方低、中、高剂量组（1、2.5、5 g/kg，其中的中剂量为人临 Hmgcr AGCTTGCCCGAATTGTATGTG TCTGTTGTGAACCATGTGACTTC 104
床等效剂量），每组 12 只；另取 12 只 C57BLKS/J（db/m） Insig-1 TGTCGGTTTACTGTATCCCTGT GTTGATGCCAACGAACACGG 109
小鼠作为正常对照组（后文统一为“db/m 组”，予生理盐 人 SREBP-1c ACAGTGACTTCCCTGGCCTAT GCATGGACGGGTACATCTTCAA 98
ACC1 ATGTCTGGCTTGCACCTAGTA CCCCAAAGCGAGTAACAAATTCT 112
水）。各组小鼠每天灌胃药物/生理盐水1次，连续8周。 FASN CCGAGACACTCGTGGGCTA CTTCAGCAGGACATTGATGCC 96
2.1.2 样本取材及肝脏系数测定 FADS1 CCAACTGCTTCCGCAAAGAC GCTGGTGGTTGTACGGCA TA 105
SCD5 TCTAGCTCCTATACCACCACCA TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC 111
所有小鼠在灌胃8周后，称体重，然后眼眶取血并以
β-ACTIN CATGTACGTTGCTATCCAGGC CTCCTTAATGTCACGCACGAT 126
3 000 r/min 离心 20 min，取血清，后续用于检测血脂四 SREBP-2 AACGGTCATTCACCCAGGTC GGCTGAAGAATAGGAGTTGCC 103
项。摘除小鼠肝脏并称重，计算肝脏系数：肝脏系数 DHCR24 GCCGCTCTCGCTTATCTTCG GTCTTGCTACCCTGCTCCTT 97
FDPS TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG CTAAAATTGCCATTCCACGAGC 108
（%）＝肝重（g）/体重（g）×100%。将一部分肝脏用 4%
HMGCR CCTGGCATCATCGCCTGTT AGAGTGACATTCCTCTGGATCTG 106
多聚甲醛固定，另一部分在－80 ℃冰箱中冷冻保存。 INSIG-1 CATGTACGTTGCTATCCAGGC CTCCTTAATGTCACGCACGAT 93
2.1.3 小鼠血脂四项检测 每组选取3只小鼠的样本，解冻后用含蛋白酶抑制剂和
取“2.1.2”项下血清，按照相应试剂盒说明书操作，
磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取组织中总蛋白，以
检测血清中TC、TG、LDL和HDL水平。
BCA 法对总蛋白进行定量。取 20 μg 高温变性的蛋白
2.1.4 小鼠肝组织脂质蓄积情况检测
进行 SDS-PAGE 电泳（电泳时间 90 min，电压 80 V 转
取“2.1.2”项下用 4% 多聚甲醛固定 24 h 的肝组织，
120 V），并转印到活化的 PVDF膜上（转膜电流350 mA，
常规石蜡包埋切片（厚度4 μm），蒸馏水浸洗，60%异丙
转 膜 时 间 120 min），5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2 h。 加 入
醇浸洗2 min，37 ℃油红O染色10 min，60%异丙醇调色
SREBP1、SREBP2、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 000），
后，蒸馏水洗，苏木素复染1.5 min，冲洗后甘油封片。显
4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤3次后，加入HRP标记的山
微镜下观察肝组织脂肪变性及肝组织脂质蓄积情况，阳
羊抗兔及山羊抗小鼠 IgG二抗（稀释比例均为1∶10 000），
性表达呈红色。使用Image Pro Plus 软件计算红色的阳
室温孵育 2 h。使用 ECL Plus 超敏发光液孵育条带，并
性区域面积，计算脂滴阳性面积百分比：脂滴阳性面积
用 ChemiDoc XRS 系统显影。采用 ImageJ V1.8.0 软件
百分比（%）＝红色脂滴面积/所测视野面积×100%。
进行灰度值统计分析，以目的蛋白与内参（β-actin）蛋白
2.1.5 小鼠肝组织中SREBPs靶基因表达检测
条带灰度值的比值表示 SREBP1、SREBP2 蛋白的表达
采用RT-qPCR法检测小鼠肝组织中SREBPs靶基因
水平。实验重复3次。
的mRNA表达。取“2.1.2”项下冻存的小鼠肝组织，每组
2.2 益肾通络方改善细胞脂质代谢异常的体外实验
选取3只小鼠的样本，采用Trizol法提取组织中总RNA，使
TM
用Nanodrop2000系统测定总RNA浓度。按BeyoRT Ⅲ 2.2.1 细胞培养及体外脂质代谢异常模型的构建
cDNA 第一链合成试剂盒说明书操作将 RNA 逆转录成 由于HepG2细胞在低脂血清条件下培养时，细胞中
[14]
cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 扩增条 SREBPs 会稳定表达 ，因此，本研究参考文献[15]采用
件如下：93 ℃预变性 60 s；93 ℃变性 60 s，55 ℃退火 30 低脂培养的方法构建体外 HepG2 细胞脂质代谢异常模
s，72 ℃延伸 30 s，循环 40 次。以 β-actin 为内参，采用 型，具体操作如下：将细胞接种在含5％胎牛血清、1%青
2 －ΔΔCt 法分析目的基因mRNA表达水平。实验重复3次。 霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，在 37 ℃、5%CO2条件
引物序列及扩增产物大小见表 1（引物由郑州点睛科技 培养 24 h，待细胞生长至融合度达到 70% 时，将细胞转
有限公司设计并合成）。 移至低脂血清培养基[DMEM培养基-F12K培养基（1∶1，
2.1.6 小鼠肝组织中SREBPs蛋白表达检测 V/V），加入 5% 低脂血清（LPDS）、50 μmol/L 甲羟戊酸
采用 Western blot 法检测小鼠肝组织中 SREBP1、 钠、10 μmol/L美伐他汀和1%青霉素-链霉素，上述各样
SREBP2 蛋白表达。取“2.1.2”项下冻存的小鼠肝组织， 品的总体积占5%]中继续培养24 h。
中国药房 2023年第34卷第23期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 23 · 2837 ·
