Page 60 - 《中国药房》2023年22期
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射生理盐水；IRN-H+CCL2 组小鼠灌胃 20 mg/kg IRN，                GAPDH 一抗（稀释比均为 1∶500）加至聚偏二氟乙烯膜
                                 [10]
          同时腹腔注射7.5 ng CCL2 ；哮喘组及空白对照组小鼠                      上，摇床孵育 30 min，4 ℃静置过夜；以TBST缓冲液洗
          分别灌胃及腹腔注射等体积的生理盐水，每天 1 次，连                          膜，室温下加入二抗（稀释比为1∶1 000），摇床孵育2 h；
          续2周。                                                TBST 缓冲液洗膜，将膜浸泡在 ECL 化学发光液中进行
          2.2 小鼠呼吸间歇值的检测                                      显色、成像。使用Image J软件对蛋白条带进行量化，以
              干预结束后，小鼠按 50 mg/kg 腹腔注射 2% 戊巴比                  目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带的灰度值比值表示
          妥钠，麻醉成功后，切开气管进行插管。将小鼠放入与                            目标蛋白的表达水平。
          呼吸机相连的空腔中，待其呼吸稳定后，分别以 3.125、                        2.8 统计学方法
          6.25、12.5 mg/mL 乙酰甲胆碱激发，以分析气道高反应                        采用 SPSS 27.0 软件对实验数据进行统计分析，并
          指标——呼吸间歇（enhanced pause，Penh）值。                     以 GraphPad Prism 8.0 软件作图。计量资料以 x±s 表
          2.3 标本采集                                            示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较
              气道高反应指标检测结束后，摘除小鼠眼球，取血                          采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          0.3～0.5 mL，在室温下静置 2 h 后，以 2 500 r/min 离心            3 结果
          20 min，收集血清储存在－80 °C下备用；然后，处死小鼠                     3.1 IRN对小鼠Penh值的影响
          进行组织分离并暴露气管，用0.5 mL预冷的PBS冲洗左                            小鼠分别用 3.125、6.25、12.5 mg/mL 乙酰甲胆碱激
          肺，收集支气管肺泡灌洗液，在 4 ℃下以 1 500 r/min 离
                                                              发后，与空白对照组比较，哮喘组小鼠 Penh 值均显著增
          心10 min，收集上清液储存在－80 °C下备用；分离右肺
                                                              加（P＜0.05）；与哮喘组比较，IRN-L 组、IRN-H 组、阳性
          组织，部分固定在 4% 甲醛溶液中，用于病理学检测，另
                                                              对照组小鼠 Penh 值均显著降低（P＜0.05）；与 IRN-L 组
          一部分储存在－80 °C下备用。
                                                              比较，IRN-H 组、阳性对照组小鼠 Penh 值均显著降低
          2.4 小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平的检测
                                                             （P＜0.05）；IRN-H 组与阳性对照组比较，差异均无统计
              取“2.3”项下血清样本，按照试剂盒说明书进行操
                                                              学意义（P＞0.05）；与 IRN-H 组比较，IRN-H+CCL2 组小
          作，利用多功能酶标仪检测吸光度值，然后根据标准曲
                                                              鼠Penh值均显著增加（P＜0.05）。结果见表1。
          线计算小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平。
                                                              表1 各组小鼠气道高反应指标 Penh 值的检测结果
          2.5 小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的检测
                                                                  （x±s，n＝10）
              取“2.3”项下支气管肺泡灌洗液上清液，以 PBS 重
                                                              组别       3.125 mg/mL剂量下Penh值  6.25 mg/mL剂量下Penh值  12.5 mg/mL剂量下Penh值
          悬，在细胞沉降前将细胞悬液移入离心管中，并进行瑞                            空白对照组       0.11±0.01     0.86±0.09    2.07±0.21
          氏染色，将混合物孵育5 min，采用全自动细胞计数器对                         哮喘组         0.65±0.07 a   2.14±0.22 a  6.54±0.66 a
          炎症细胞[嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）、淋巴细胞                    IRN-L组      0.45±0.05 b   1.57±0.16 b  3.85±0.39 b
                                                              IRN-H组      0.21±0.03 bc  1.02±0.11 bc  2.27±0.23 bc
         （lymphocyte，LYM）和中性粒细胞（neutrophil，NEU）]进             IRN-H+CCL2组  0.52±0.06 d  1.66±0.17 d  4.48±0.45 d
          行分类计数。                                              阳性对照组       0.18±0.02 bc  0.92±0.10 bc  2.11±0.22 bc
          2.6 小鼠肺组织病理学变化及炎症细胞浸润评分的                               a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与哮喘组比较，P＜0.05；c：与
          检测                                                  IRN-L组比较，P＜0.05；d：与IRN-H组比较，P＜0.05。
              取“2.3”项下固定在4%甲醛溶液的小鼠肺组织，经                       3.2 IRN对小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平的影响
          石蜡包埋、切片（5 μm）后用 HE 染色。使用光学显微镜                           与空白对照组比较，哮喘组小鼠血清中IL-4、IL-13、
                                              [11]
          下观察肺组织病理学变化，参照文献方法 评估炎症细                            TNF-α水平均显著升高（P＜0.05）；与哮喘组比较，IRN-
          胞浸润评分，评分标准如下：0分，无炎症细胞浸润；1分，                         L 组、IRN-H 组、阳性对照组小鼠血清中 IL-4、IL-13、
          少量炎症细胞浸润；2 分，层厚为 1 个细胞，炎症细胞构                        TNF-α 水平均显著降低（P＜0.05）；与 IRN-L 组比较，
          成环状；3分，层厚为2～4个细胞，炎症细胞构成环状；4                         IRN-H组、阳性对照组小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水
          分，层厚大于4个细胞，炎症细胞构成环状。                                平均显著降低（P＜0.05）；IRN-H 组与阳性对照组比较，
          2.7 小鼠肺组织中MCP-1、CCR2蛋白表达水平的检测                       差异均无统计学意义（P＞0.05）；与IRN-H组比较，IRN-
              取“2.3”项下冻存的小鼠右肺组织，加入 RIPA 缓冲                    H+CCL2 组小鼠血清中 IL-4、IL-13、TNF-α 水平均显著
          液研磨后于冰上裂解，离心后（4 ℃，3 000 r/min，15 min）               升高（P＜0.05）。结果见表2。
          取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，沸                           3.3 IRN 对小鼠支气管肺泡灌洗液中 EOS、LYM 和
          水煮10 min使蛋白变性；每个样品取40 μg变性蛋白，经                      NEU数量的影响
          过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（电压 90                              与空白对照组比较，哮喘组小鼠支气管肺泡灌洗液
          V），并在冰上转移到聚偏二氟乙烯膜上，加入5%脱脂奶                          中 EOS、LYM、NEU 数量均显著增加（P＜0.05）；与哮喘
          粉，室温下封闭 2 h；将封闭液稀释的 MCP-1、CCR2、                     组比较，IRN-L 组、IRN-H 组、阳性对照组小鼠支气管肺


          · 2742 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 22                            中国药房  2023年第34卷第22期
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