Page 48 - 《中国药房》2023年21期
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meanwhile  increased  TREM2  expression  without  effect  on  cell  viability，  and  0.1  μmol/L  chlorogenic  acid  was  taken  in  the  next
          experiments.  Compared  with  the  control  group，  the  protein  expressions  of  iNOS  and  NF- κB  p65  in  the  LPS  group  were
          significantly  increased （P＜0.05）；  compared  with  the  LPS  group，  the  protein  expressions  of  iNOS  and  NF- κB  p65  in  the
          chlorogenic  acid+LPS  group  were  significantly  decreased，  the  protein  expressions  of  TREM2  was  significantly  increased （P＜
          0.05）；  compared  with  the  chlorogenic  acid+LPS  group，  the  protein  expressions  of  iNOS  and  NF- κB  p65  of  TREM2-siRNA+
          chlorogenic acid+LPS group were significantly increased， the protein expressions of TREM2 was significantly decreased （P＜0.05）.
          TREM2-siRNA  could  significantly  reverse  the  above  effects  of  chlorogenic  acid，  while  SC-siRNA  did  not  significantly  affect  the
          above  anti-inflammatory  effects  of  chlorogenic  acid.  CONCLUSIONS  Chlorogenic  acid  can  inhibit  the  LPS-induced  macrophage
          activation， and its anti-inflammatory may be mediated by TREM2 protein.
          KEYWORDS     chlorogenic acid； macrophage； lipopolysaccharide； inflammation； triggering receptors expressed on myeloid cells-2



              巨噬细胞过度激活与多种炎症相关疾病的发生发                           TNF-α、IL-1β和IL-6促炎性细胞因子检测试剂盒（批号
          展密切相关，包括川崎病、自身免疫性肝病、肾病和心肌                           分别为20220314、20220517、20220418）均购自中国南京
          疾病等   [1―3] 。巨噬细胞过度激活后，可释放多种促炎性                     建成生物工程研究所；兔抗小鼠诱导型一氧化氮合酶（in‐
          细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，             ducible nitric oxide synthase，iNOS）（批号ab178945）、核因
          TNF-α）、白细胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）和 IL-6         子 κB  p65（nuclear  factor  κB  p65，NF- κB  p65）（批 号
          等。上述促炎性细胞因子可通过血液循环损伤体内多                             ab32536）一 抗 和 山 羊 抗 兔 IgG 预 吸 附 二 抗（批 号
                                                    [4]
          个脏器，继而造成脏器功能受损，甚至危及生命 。因                            ab7090）均购自英国 Abcam 公司；TREM2 小干扰 RNA
          此，可通过抑制巨噬细胞的过度激活，降低炎症反应水                           （TREM2-small interfering RNA，TREM2-siRNA）（批号
                                       [5]
          平，进而控制相关疾病的发生发展 。                                   HU079401）、乱序-siRNA（SC-siRNA，批号SIC001）和转
              绿原酸是富含于中药金银花中的一种苯丙素类化                           染液（批号 L3287）均购自瑞士 Qiagen 公司；Cy3 标记的
          合物，具有抗炎、抗氧化、抗过敏和利胆等药理作用 。                           山羊抗兔荧光二抗（批号 A0516）和青链霉素混合溶液
                                                        [6]
          目前，关于绿原酸的相关研究多聚焦在抑制炎症反应方
                                                             （批号C0223）均购自中国碧云天生物技术有限公司。
          面。有研究报道，绿原酸的抗炎机制包括抑制巨噬细胞/
                                                              1.3 细胞系
          小胶质细胞激活和调节p38分裂原激活的蛋白激酶/Toll
                                                                  实验用小鼠RAW264.7巨噬细胞系获赠于中国科学
                              [7]
          样受体等细胞信号通路 ，但其详细抑炎机制尚不明确。
                                                              院 上 海 生 命 科 学 研 究 所 。 RAW264.7 巨 噬 细 胞 在
          骨 髓 细 胞 2 表 达 的 触 发 受 体（triggering  receptors  ex‐
                                                              DMEM细胞培养基中培养，培养基含10%胎牛血清、10
          pressed on myeloid cells-2，TREM2）是表达于巨噬细胞
                                                              U/mL 的青霉素和 10 μg/mL 的链霉素。培养箱内空气
          上的一种蛋白，可调控巨噬细胞激活程度，抑制炎症反
                                                              含95%O2和5%CO2，温度为37 ℃，湿度为100%。每2～
            [8]
          应 。本研究使用经典致炎物质脂多糖（lipopolysaccha‐
                                                              3 d 更换培养基 1 次，每周以 1∶4 的比例传代 2 次。取对
          ride，LPS）刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞，模拟巨噬细胞
                                                              数生长期细胞进行后续实验。
              [9]
          激活 ，观察绿原酸对 LPS 所致巨噬细胞激活的影响和
                                                              2 方法
          TREM2 在其中的作用，为阐明绿原酸的抗炎机制提供
                                                              2.1 LPS造模浓度的筛选
          实验室证据。
          1 材料                                                2.1.1 细胞分组及处理
                                                                  为确定适宜的LPS刺激强度，将细胞分为Control组
          1.1 主要仪器
              Series 2型细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scien-          和不同质量浓度（1、10、100 ng/mL，参考预实验结果设
          tific 公司；Infinite 200 型酶标仪购自瑞士 Tecan 公司；            置）LPS处理组。细胞在含有上述药物的培养基/空白培
          Criterion型电泳仪和GelDoc Go型凝胶成像系统均购自                   养基内孵育24 h后，进行以下各项检测。
          美国 Bio-Rad 公司；FV10i 型共聚焦显微镜购自日本                     2.1.2 细胞培养上清液中IL-6水平的检测
                                                                                                   5
          Olympus公司。                                              将细胞接种于 24 孔板中，密度为 5×10 个/孔，24 h
          1.2 主要药品与试剂                                         细胞贴壁后，按“2.1.1”项下方法分组（每组8个复孔）、给
              绿原酸原料药（批号327-97-9，纯度＞95%）、DMEM                  药、培养细胞，然后提取各孔细胞培养上清液200 μL置
          细胞培养基（批号 D5796）、胎牛血清（批号 9014-87-7）、                 于离心管内，于 4 ℃下 5 000 r/min 离心 30 min。离心结
          二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批号 67-68-5）          束后，吸弃上清液 150 μL，根据 IL-6 试剂盒说明书检测
          和MTT（批号298-93-1）均购自美国Sigma-Aldrich公司；               IL-6水平。


          · 2602 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 21                            中国药房  2023年第34卷第21期
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