Page 49 - 《中国药房》2023年21期
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2.1.3 细胞中iNOS蛋白表达水平的检测                             法进行细胞分组（每组8个复孔）、给药和培养。培养结
              采用 Western blot 法检测细胞中 iNOS 蛋白的表达              束后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37 ℃孵育4
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          水平。将细胞接种于6孔板中，密度为1×10 个/孔，24 h                     h后；吸弃上层培养基，每孔加入150 μL的DMSO，振荡
          细胞贴壁后，按“2.1.1”项下方法分组（每组4个复孔）、给                     15 min，待甲瓒完全溶解后，取空白孔加 150 μL 蒸馏水
          药、培养细胞。培养结束后，吸弃上层培养基，采用磷酸                          作为空白组，在490 nm波长处使用酶标仪检测各孔吸光
          盐 缓 冲 液（phosphate  buffer  saline，PBS）清 洗 3 次（5    度，计算细胞活力。细胞活力（%）＝（实验组吸光度－
          min/次），然后每孔加入细胞裂解液500 μL，在4 ℃下裂                    空白组吸光度）/（Control 组吸光度－空白组吸光度）×
          解5 min，采用细胞刮将细胞收集至清洁的离心管内，在                        100%。
          4 ℃下以 12 000 r/min 离心 30 min 后，收集上清液，采用            2.3 TREM2 在绿原酸抑制巨噬细胞激活中的作用
          Bradford 法进行蛋白定量。取蛋白进行高温变性后，进                      考察
          行聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压 120 V，电泳时间 2 h），并                    2.3.1 转染 TREM2-siRNA 对巨噬细胞中 TREM2 蛋白
          转移至聚偏二氟乙烯膜上（转膜电流200 mA，转膜时间                        表达水平的影响
                                                                                                 6
          2 h），加入 5% 脱脂奶粉封闭非特异性抗原，4 ℃孵育过                         将细胞接种于6孔板中，密度为1×10 个/孔。接种
          夜；加入稀释的 iNOS、GAPDH 一抗（稀释比例分别为                      24  h 后 ，吸 弃 上 层 培 养 基 ，每 孔 加 入 含 90  pmol 的
          1∶500、1∶1 000），在37 ℃下孵育4 h；洗膜后加入山羊抗                TREM2-siRNA转染液1 mL，37 ℃孵育6 h后，吸弃上层
          兔 IgG 预吸附二抗（稀释比例为 1∶1 000），室温孵育 60                 转染液；PBS 常温清洗 3 次，每孔加入细胞裂解液 200
          min；使用化学发光法显色后，采用凝胶成像系统成像，                         μL，裂解 30 min 后，收集细胞；按“2.2.3”项下方法检测
          使用Image Lab软件分析各条带的灰度值，以iNOS蛋白                     细胞中TREM2蛋白的表达水平。实验重复4次。
          与 GAPDH 蛋白的灰度值比值表示 iNOS 蛋白的表达                      2.3.2 细胞分组及处理
          水平。                                                    为观察TREM2在绿原酸抑制巨噬细胞激活中的作
          2.2 绿原酸给药浓度的筛选                                     用，将细胞分为Control组、LPS处理组（10 ng/mL LPS）、
          2.2.1 细胞分组及处理                                      绿原酸+LPS组[培养基含1 μmol/L绿原酸（按“2.2”项下
              参考相关文献中的绿原酸浓度 ，将细胞分为Con‐                       结果设置）和 10 ng/mL LPS]、TREM2-siRNA+绿原酸+
                                        [10]
          trol组、LPS处理组（10 ng/mL，按“2.1”项下结果设置，下               LPS组（细胞经TREM2-siRNA处理后，再经1 μmol/L绿
          同）和不同浓度绿原酸干预组（培养基分别含 0.01、0.1、                     原酸和 10 ng/mL LPS 处理）和 SC-siRNA+绿原酸+LPS
          1 μmol/L 绿原酸和10 ng/mL LPS），每组8个复孔。将细               组（细胞经 SC-siRNA 处理后，再经 1 μmol/L 绿原酸和
          胞在含有上述药物的培养基/空白培养基中常规孵育24                          10 ng/mL LPS处理），每组8个复孔。在含有上述药物的
          h后，进行以下各项检测。                                       培养基/空白培养基中孵育24 h后，进行以下各项检测。
          2.2.2 细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平的检测                     2.3.3 干扰 TREM2 表达后细胞培养上清液中 TNF-α、
              按“2.1.2”项下方法接种细胞，常规培养，待细胞贴                     IL-1β水平的检测
          壁后，按“2.2.1”项下方法进行细胞分组、给药与培养，然                          按“2.1.2”项下方法接种细胞，常规培养，待细胞贴
          后根据TNF-α和IL-1β试剂盒说明书检测细胞培养上清                       壁后，按“2.3.2”项下方法进行细胞分组、给药，根据TNF-α、
          液中TNF-α、IL-1β水平。                                   IL-1β 试剂盒说明书检测细胞培养上清液中 TNF-α、IL-
          2.2.3 细胞中iNOS、TREM2蛋白表达水平的检测                       1β水平。
              采用Western blot法检测细胞中iNOS、TREM2蛋白               2.3.4 干扰TREM2表达后细胞中iNOS蛋白染色情况的
          的表达水平。按“2.1.3”项下方法接种细胞，常规培养，                       检测
          待细胞贴壁后，按“2.2.1”项下方法进行细胞分组（每组4                          将细胞接种于共聚焦显微镜专用培养皿中，密度为
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          个复孔）、给药、培养，按“2.1.3”项下方法进行指标检测。                     1×10 个/孔。接种 24 h 后，按“2.3.2”项下方法分组处
          本实验中 iNOS、GAPDH、TREM2、β-actin 一抗的稀释                理，吸去上层培养基，每孔加入 4% 多聚甲醛溶液 1 mL
          比例分别为 1∶500、1∶1 000、1∶200、1∶1 000。以 iNOS           固定，30 min后，PBS清洗3次，5 min/次；随后，每孔加入
          蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值表示iNOS蛋白的表达                        1% 牛血清白蛋白 1 mL 包被非特异性抗原，30 min 后，
          水平，以TREM2蛋白与β-actin 蛋白的灰度值比值表示                     PBS 清洗 1 次；每孔加入 iNOS 一抗（稀释比例为 1∶
          TREM2蛋白的表达水平。                                      100），在 4 ℃下孵育 12 h 后，PBS 清洗 3 次，5 min/次；每
          2.2.4 细胞活力的检测                                      孔加入 Cy3 标记的山羊抗兔荧光二抗（稀释比例为 1∶
              采用MTT法检测细胞活力。将细胞接种于96孔板                        100）200 μL，常温避光孵育 90 min；随后，每孔加入 100
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          中，密度为1×10 个/孔，待细胞贴壁后，按“2.2.1”项下方                   μL 的 DAPI 染液标记细胞核（蓝色），常温避光孵育 5

          中国药房  2023年第34卷第21期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 21    · 2603 ·
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