Page 20 - 《中国药房》2023年19期

（carcinoembryonic antigen，CEA）（批号分别为F2632-A、 水，每日 1 次，干预 4 周。药物干预结束后，小鼠眼球取
F2630-A）均购自上海科兴生物科技有限公司；总胆固醇 血后静置2 h，以3 000 r/min离心20 min，取上清液，－80 ℃
（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密 保存。取一半小鼠的肝脏组织用 4% 多聚甲醛固定，另
度 脂 蛋 白 胆 固 醇（low-density lipoprotein cholesterol， 一半小鼠的肝脏组织冻存于－80 ℃冰箱，备用。
LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein 2.3 小鼠的一般情况、体重、肝重及肝脏系数的比较
cholesterol，HDL-C）测定试剂盒（批号分别为20210806、 在模型建立及药物干预期间，对小鼠的饮食、毛色
20210809、20210806、20210809）均购自南京建成生物工 和状态等一般情况进行监测；药物干预结束后，眼球采
程研究所有限公司；兔源微管相关蛋白 1A/1B-轻链 3 血前称量小鼠体重，取材时，快速取出肝脏，肉眼观察小
（microtubule-associated proteins 1A and 1B，LC3）、苄氯 鼠肝脏形态并称重，每组随机选取6只小鼠计算肝脏系
素 1（Beclin1）、选择性自噬接头蛋白 P62、B 细胞淋巴瘤 数。肝脏系数＝肝重（g）/体重（g）×100%。
2 相关 X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，Bax）、甘 2.4 小鼠肝脏组织病理形态学观察
油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy‐ 采用苏木素-伊红（HE）染色法观察小鼠肝脏组织病
drogenase，GAPDH）、增殖标志物Ki-67蛋白多克隆抗体 理形态。每组随机选取固定在4%多聚甲醛中的3只小
和鼠源 B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）单克 鼠肝脏组织，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后，进行石蜡
隆抗体（批号分别为 14600-1-AP、11306-1-AP、18420-1- 包埋和切片；取部分石蜡切片按 HE 染色常规方法进行
AP、50599-2-Ig、60004-1-Ig、28074-1-AP、68103-1-Ig）均 染色（剩余部分用于后续 Masson 染色及免疫组化染
购自武汉Proteintech公司；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠 色），然后采用数字扫描显微成像系统观察肝脏组织病
IgG二抗（批号分别为CW0103、CW0102）均购自江苏康 理形态。
为世纪生物科技有限公司。 2.5 小鼠肝脏组织纤维化程度检测
1.3 实验动物与饲料 采用Masson染色法检测小鼠肝脏组织中胶原纤维
3周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠50只，体重（10±2） 含量的变化情况以明确小鼠肝脏组织纤维化程度。取
g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可 “2.4”项下各组小鼠肝脏组织石蜡切片，按 Masson 染色
证号为 SCXK（辽）2021-0001。小鼠饲养于辽宁中医药 常规方法进行染色，切片经脱蜡、染色、分化、复染、脱
大学实验动物中心，自由饮水进食。实验符合辽宁中医 水、透明后封固，以数字扫描显微成像系统观察。每张
药 大 学 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 标 准（伦 理 批 准 号 切片随机选取3个不重复视野，采用Image J软件计算肝
21000042022042）。高脂饲料（10% 猪油、5% 蔗糖、1% 脏胶原面积百分比以表示胶原纤维含量。肝脏胶原面
胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%甲基硫氧嘧啶、83.3%普通饲 积百分比（%）＝肝脏胶原面积/所测视野面积×100%。
料）购自小黍有泰（北京）生物科技有限公司，批号为 2.6 小鼠血脂水平及血清中肿瘤标记物 AFP、CEA 含
200426012。 量检测
2 方法 随机选取 6 只小鼠的血清，采用微板法检测小鼠血
2.1 LGZG水提液的制备 脂水平（TG、TC、LDL-C和HDL-C水平），采用ELISA法
取茯苓25 g、桂枝25 g、白术15 g、甘草10 g，混合后 检测小鼠血清中 AFP、CEA 含量，均严格按照试剂盒说
加入10倍量水浸泡1 h后，加热回流提取2 h；过滤，回收 明书进行操作。
溶剂，再加入 10 倍量水继续回流提取 2 h；合并 2 次滤 2.7 小鼠肝脏组织中 Ki-67 蛋白及凋亡标志蛋白表达
液，浓缩成质量浓度为 1 g/mL 的溶液（以生药量计），于 水平检测
[7]
4 ℃保存备用 。 采用免疫组化法进行检测。取“2.4”项下各组小鼠
2.2 动物分组干预及取材 （每组3只）肝脏组织石蜡切片，经热抗原修复、灭活内源
50只小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分 酶、封闭后，滴加 Ki-67 和凋亡标志蛋白（Bax、Bcl-2）一
为空白组、NAFLD-HCC 组、LGZG 组、DOX 组、DOX+ 抗（稀释比均为 1∶200）孵育 1 h；PBS 清洗后加入二抗
LGZG 组，每组 10 只。除空白组外，其余各组小鼠腹腔 （稀释比为 1∶100）孵育 30 min；以 PBS 清洗后进行 DAB
注射二乙基亚硝胺溶液（50 mg/kg），每周 1 次，连续 8 显色、苏木素复染、盐酸乙醇分化、脱水、封片和观察。
[8]
周 。小鼠在给予二乙基亚硝胺溶液 4 周后，再同时以 利用 Image Pro plus 6.0 软件进行免疫组化结果分析，以
高脂饲料喂养，连续 12 周，建立 NAFLD-HCC 小鼠模 平均光密度值表示蛋白表达水平。
[7]
型 ；空白组小鼠给予普通饲料喂养。建模后，按人与小 2.8 小鼠肝脏组织中自噬相关蛋白表达水平的检测
鼠体表面积比换算给药等效剂量，各给药组小鼠分别灌 采用 Western blot 法进行检测。每组随机选取 3 只
[7]
胃 LGZG 水提液（20 g/kg ）和/或腹腔注射 DOX 溶液（8 小鼠的肝脏组织，每只取0.1 g，加入1 mL RIPA裂解液，
[7]
mg/kg ），空白组、NAFLD-HCC组小鼠灌胃等量生理盐 充分匀浆并置于冰上裂解 30 min，离心后取上清液；采

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