Page 50 - 《中国药房》2023年17期
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          mm；Ⅳ级＞2 mm 。计算肺表面转移结节总数和肺转                          作进行蛋白定量。取 45 μg 变性后总蛋白，经十二烷基
          移抑制率：肺表面转移结节总数＝Ⅰ级结节数量×1+Ⅱ                           硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转膜，以5%脱脂奶
          级结节数量×2+Ⅲ级结节数量×3+Ⅳ级结节数量×4；                          粉封闭；加入相应一抗（E-cadherin稀释比例1∶1 000、vi‐

          肺转移抑制率（%）＝（模型组平均肺表面转移结节数－                           mentin 稀释比例 1∶1 000、β-catenin 稀释比例 1∶1 000、
          玉屏风颗粒组平均肺表面转移结节数）/模型组平均肺表                           β-actin 稀释比例 1∶5 000），4 ℃孵育过夜。次日将条带
          面转移结节数×100%。                                        洗涤后再加入相对应的二抗（稀释比例1∶10 000），25 ℃
          2.5 肺组织肿瘤转移灶观察                                      孵育 1 h。孵育结束后，以 TBST 缓冲液洗涤、超敏 ECL
              取小鼠左肺组织，经4%多聚甲醛固定后，再经梯度                         化学发光试剂盒显影，采用凝胶成像仪进行检测分析。
                                                              采用 Image Pro Plus 软件进行光密度分析，以 EMT 相关
          脱水、常规石蜡包埋、切片（5 μm）、苏木素-伊红（HE）染
                                                              蛋白条带光密度值与内参蛋白（β-actin）条带光密度值的
          色，于显微镜下观察肺组织肿瘤转移灶。
                                                              比值表示目的蛋白的相对表达水平。
          2.6 肺组织癌胚抗原表达检测
                                                              2.9 统计学方法
              取“2.5”项下小鼠肺组织石蜡切片，常规脱蜡、抗原
                                                                  采用 SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析，Graph‐
          修复、封闭后，滴加癌胚抗原一抗（稀释比例 1∶200），
                                                              pad Prism 8软件作图。计量资料以x±s表示，多组间比
          4 ℃孵育过夜；次日洗涤后，滴加 HRP 标记的山羊抗兔
                                                              较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。
          IgG（H+L）二抗（稀释比例 1∶50），室温孵育 50 min；以
                                                              检验水准α＝0.05。
          DAB显色，苏木素染液复染细胞核，脱水封片，于显微镜
                                                              3 结果
          下观察肺组织中癌胚抗原的表达情况。每张切片在显
                                                              3.1 一般情况观察结果
          微镜下选取3个视野，以棕黄色为阳性表达，采用Image
                                                                  与正常组比较，模型组小鼠精神萎靡，活动减少，毛
          J 软件计算平均光密度值，平均光密度值越大表示癌胚
                                                              发晦暗无光泽；与模型组比较，玉屏风颗粒组小鼠精神
          抗原的表达水平越高。
                                                              状态较好，毛发稍有光泽。
          2.7 肺组织中EMT相关基因mRNA表达水平检测
                                                              3.2 肺组织肿瘤转移灶计数及肺转移抑制率计算结果
              采用 qRT-PCR 法进行检测。每组随机选取 5 只小
                                                                  与正常组比较，模型组、玉屏风颗粒组小鼠肺组织
          鼠 的 肺 组 织 ，采 用 Trizol 法 提 取 组 织 中 总 RNA，按
                                                              中出现了肿瘤转移灶；与模型组比较，玉屏风颗粒组小
          FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒操作将其反转录为                     鼠肺表面转移结节总数显著减少（P＜0.05），其肺转移
          cDNA 后，按 SuperReal PreMix SYBR Green qPCR 检测        抑制率为46.52%。结果见表2。
          试剂盒说明书进行 PCR 扩增。扩增反应条件为：95 ℃
                                                              表2 各组小鼠肺组织肿瘤转移灶计数及肺转移抑制率
          预变性 15 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火/延伸 32 s，共                  测定结果（x±s，n＝10）
          40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2          －ΔΔCt 法，以对照组       组别                  肺表面转移结节总数/个     肺转移抑制率/%
          为参照进行标准化处理，计算 EMT 相关基因 mRNA 的                       正常组                      －             －
                                                              模型组                    1.87±0.95       －
          相对表达水平。PCR引物由笔者采用Primer 3.0软件自                      玉屏风颗粒组                 1.00±0.00 a    46.52
          行设计，经NCBI数据库核查后，由上海生工生物工程技                             a：与模型组比较，P＜0.05。
          术有限公司合成。引物序列及扩增产物长度见表1。                             3.3 肺组织肿瘤转移灶HE染色结果
                    表1 引物序列及扩增产物长度                                与正常组比较，模型组小鼠左肺组织出现肿瘤转移
           目的基因                  引物序列             产物长度/bp     灶，与邻近组织有明显的分界；与模型组比较，玉屏风颗
           β-catenin    上游：5′-TGCCGTTCGCCTTCATTATGGAC-3′  122  粒组小鼠肿瘤转移灶变小，组织大体形态有所恢复。
                        下游：5′-TGGGCAAAGGGCAAGGTTTCG-3′
           E-cadherin   上游：5′-GGGCTGGACCGAGAGAGTTACC-3′  121  HE染色结果见图1。
                        下游：5′-CGTGCTTGGGTTGAAGACAGGAG-3′      3.4 肺组织癌胚抗原表达检测结果
           vimentin     上游：5′-CCCTGGACATTGAGATCG-3′  118
                        下游：5′-AAGAAAAGGTTGGCAGAGG-3′              与正常组（平均光密度值为52.17±7.00）比较，模型
           GAPDH        上游：5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGCATC-3′  120  组 小 鼠 肺 组 织 癌 胚 抗 原 的 表 达（平 均 光 密 度 值 为
                        下游：5′-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3′
                                                              258.40±15.65）显著增强（P＜0.05），且呈散在性分布；
          2.8 肺组织中EMT相关蛋白表达水平检测                               与模型组比较，玉屏风颗粒组小鼠肺组织癌胚抗原的表
              采用 Western blot 法进行检测。每组取 3 只小鼠的                达（平均光密度值为 50.48±7.03）显著减弱（P＜0.05）。
          肺组织，匀浆，提取总蛋白，按照 BCA 试剂盒说明书操                         免疫组化染色结果见图2。


          · 2092 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 17                            中国药房  2023年第34卷第17期
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