Page 49 - 《中国药房》2023年17期
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性肿瘤组织的上、下皮细胞转化成间质细胞，使细胞间                           KR106）、SuperReal PreMix SYBR Green qPCR检测试剂
          连接（紧密连接、黏附连接、桥粒/半桥粒等）解体，导致细                        盒（批号FP204）均购自天根生化科技（北京）有限公司。
          胞表面的上皮标志物[如 E-钙黏蛋白（E-cadherin）、细胞                  1.3 实验动物
          角蛋白、紧密连接蛋白 1（Zona occludens 1，ZO-1）等]表                 本研究所用动物为SPF级雌性C57BL/6纯系小鼠，

          达水平逐渐降低，而间充质标志物[如 N-钙黏蛋白（N-                        共35只，体重（20±2） g，购于北京维通利华实验动物技
          cadherin）、波形蛋白（vimentin）、纤连蛋白等]表达水平                术有限公司，动物生产合格证号为 SCXK（京）2016-
          升高，最终使肿瘤细胞具备转移和侵袭能力                  [1―2] 。因此，    0006。小鼠饲养期间给予普通饲料和洁净水。本研究
          抑制肿瘤细胞 EMT，改善上皮屏障功能，可能是治疗肿                         所有动物实验均严格遵循动物实验“3R”原则，严格按照
          瘤的有效靶点。                                           《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）执
              传统中医药具有靶点多、副作用少的特点，近年来                         行，并经承德医学院医学伦理委员会审查通过后实施
          有关其在治疗肿瘤方面的研究愈加深入。中医认为肿                           （伦理审查证号2019055）。
          瘤发生的病因之一为“正气内虚”，正不抗邪，邪气经人                          1.4 细胞株
                                    [3]
          体三焦、腠理等通道，四处侵染 ，即出现肿瘤的转移和                              LLC小鼠Lewis肺癌细胞株购于上海诺百生物科技
                                                             有限公司。
          侵袭。玉屏风散由黄芪、白术、防风3味药组成，是补气
                                                             2 方法
          固表的经典方剂，目前其制剂有丸剂、颗粒剂、胶囊剂、
                          [4]
          口服液等多种剂型 。研究表明，玉屏风散及其各组分                           2.1 肺癌细胞悬液的制备
                                                                 将LLC细胞常规培养并传代3次后，调整细胞密度
          可通过提高机体免疫功能、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿
                                                                     7
                                                             为 1×10 个/mL，接种至 5 只小鼠的右腋下，每只 0.2
          瘤细胞增殖、减缓肿瘤细胞侵袭和转移等起到防治肿瘤
                                                                                                      3
                                                             mL。接种第10天左右，待瘤体长至约1 000 mm 时将小
          的作用 。但是关于玉屏风散对肿瘤细胞 EMT 及上皮
                [5]
                                                             鼠脱颈处死。将生长良好的肺癌组织经匀浆、过滤、离
          屏障功能完整性影响的研究较少。鉴于此，本研究基于
                                                                                          7
                                                             心、稀释后制成细胞密度为 1×10 个/mL 的肺癌细胞混
          Lewis 荷瘤小鼠自发肺转移模型，以玉屏风颗粒为受试
                                                                 [6]
                                                             悬液 。
          药物，对上述问题进行探讨，为进一步研究玉屏风散及
                                                             2.2 动物造模、分组及给药
          其相关制剂防治肿瘤的机制提供参考。
                                                                 采用随机数字表法将剩下30只小鼠分为正常组、模
          1 材料
                                                             型组、玉屏风颗粒组，每组10只。取“2.1”项下细胞悬液
          1.1 主要仪器
                                                             0.2 mL 接种于模型组和玉屏风颗粒组小鼠的右腋皮下
              本研究所用的主要仪器有Ⅸ53型倒置显微镜、Ⅸ71
                                                             处，当该处出现小结节并不断增长时，判定小鼠自发肺
          型显微镜图像采集系统（日本 Olympus 公司），CFX96
                                                                             [7]
                                                             转移模型制备成功 。
          Touch型实时定量PCR仪、Amersham Imager 600型凝胶
                                                                 精密称取玉屏风颗粒，以蒸馏水溶解，制成质量浓
          检测成像系统（美国Bio-Rad公司）。
                                                             度为4 g/mL的玉屏风颗粒给药液，每日现配现用。接种
          1.2 主要药品与试剂
                                                             细胞悬液的第10天开始灌胃给药，正常组和模型组小鼠
              玉屏风颗粒（批号 200213，规格 5 g/袋）购自国药集                 给予蒸馏水，玉屏风颗粒组小鼠给予40 g/kg玉屏风颗粒
          团广东环球制药有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记
                                                            （根据前期预实验结果，选择20倍临床等效剂量为受试
          的 山 羊 抗 兔 免 疫 球 蛋 白 G（IgG）（H+L）抗 体（批 号             剂量），给药体积均为 0.01 mL/g。每天给药 1 次，连续
          A0208、A0216）均购自上海碧云天生物技术有限公司；                      15 d。
          Carazzi 苏木素染色液（批号 G4510）、伊红染色液（批号                  2.3 一般情况观察
          G1100）、免疫组化试剂盒（批号SA00011）均购自北京索                        给药后每天定时观察小鼠的状态，包括毛发色泽、
          莱宝科技有限公司；兔源癌胚抗原检测抗体（批号                             饮食、排便、精神、活动等。
          A12421）、兔源E-cadherin单克隆抗体（批号A3044）均购               2.4 肺组织肿瘤转移灶计数及肺转移抑制率计算
          自武汉爱博泰克生物科技有限公司；兔源 β-连环蛋白                              给药结束后将小鼠脱颈处死，取出肺组织，经生理
         （β-catenin）多克隆抗体（批号 51067-2-AP）、兔源 vimen‐           盐水漂洗后在显微镜下对肺组织肿瘤转移灶进行计数。
          tin多克隆抗体（批号10366-1AP）均购自美国Proteintech              转移灶为类圆形小突起，呈结节状或半透明点状，部分
          公司；RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒（批号                    转移灶可能融合到一起。根据肺结节直径将其分为4级：
          DP431）、FastQuant  cDNA 第 一 链 合 成 试 剂 盒（批 号         Ⅰ级＜0.5 mm；0.5 mm≤Ⅱ级≤1 mm；1 mm＜Ⅲ级≤2


          中国药房  2023年第34卷第17期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 17    · 2091 ·
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