Page 44 - 《中国药房》2023年17期
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agents，ESAs）的低反应性和铁剂治疗的诸多不良反应，                      2 方法与结果
          目前仍有许多肾性贫血患者未得到有效治疗，很大比例                            2.1 色谱条件
          的CKD合并贫血患者仍然不能达到正常血红蛋白的水                                色谱柱为 ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×50
            [3]
          平 。低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是细           mm，1.7 µm），以 2 mmol/L 醋酸铵溶液（含 0.1% 甲酸）
          胞适应低氧环境的关键性转录因子，目前已证实约有                            （A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～0.5 min，45%B；
          100多个基因受其调控，在红细胞生长、肿瘤生长和血管                          0.5～1.0 min，45%B→75%B；1.0～1.8 min，75%B；1.8～
          生长等方面发挥着重要作用             [4―5] 。脯氨酰羟化酶（prolyl       2.0  min，75%B→95%B；2.0～2.5  min，95%B；2.5～2.6
          hydroxylase domain，PHD）作为 HIF 依赖性红细胞生成              min，95%B→45%B；2.6～3.0 min，45%B）；柱温为40 ℃；
                                                        [6]
          调节剂的发现，推动了肾性贫血新治疗药物的开发 。                            流速为0.4 mL/min；进样量为1 μL。
          靶向PHD的小分子抑制剂研究已经成为当前治疗贫血/                           2.2 质谱条件
          缺血及炎症等疾病的策略之一。目前全球上市的 HIF-                              离子源为加热电喷雾电离源，采用负离子选择反应
          PHD 抑 制 剂 包 括 Roxadustat、Molidustat、Daprodustat、    监 测（selected  reaction  monitoring，SRM）模 式 扫 描 ；
          Vadadustat、Enarodustat 5个产品，其中Roxadustat作为国         SYHA1809、内 标 的 离 子 监 测 通 道 分 别 为 m/z  418→
          内唯一上市的HIF-PHD抑制剂受到许多质疑，最终未能                         374.1、351.1→173.1；碰撞能量分别为19、37 V；S-Lens电
                               [7]
          获得美国 FDA 批准上市 。因此，开发结构新颖、药效                         压分别为85、89 V；加热毛细管温度为320 ℃；碰撞气压
          更好、安全性更佳的小分子HIF-PHD抑制剂仍然迫切。                         力为1.5 mTorr。
                                                              2.3 溶液的配制
              SYHA1809 是经石药集团初筛后获得的一类创新
          型HIF-PHD抑制剂，拟用于肾性贫血患者。本研究团队                         2.3.1 储备液的配制
                                                                  取 SYHA1809 对照品适量，精密称定，加 DMSO 溶
          前期药效学实验结果显示，SYHA1809 对 PHD 1～3 均
                                                              解后，用甲醇稀释，即得质量浓度为2 mg/mL的储备液。
          有很强的抑制作用，并能升高人 Hep3B 细胞中 HIF-1α、
                                                              取内标对照品适量，精密称定，加DMSO溶解后，用甲醇
          HIF-2α 的表达，还可上调正常小鼠和双肾摘除小鼠（贫
                                                              稀释，即得质量浓度为1 mg/mL的内标储备液。上述储
          血动物模型）血浆红细胞生成素（erythropoietin，EPO）浓
                                                              备液均置于－20 ℃保存备用。
          度，上调顺铂诱导的贫血小鼠的红细胞和血红蛋白浓
                                                              2.3.2 系列标准溶液和质控溶液的配制
          度。基于此，本研究拟以比格犬为研究对象，采用液相
                                                                  精密吸取SYHA1809储备液适量，以50%甲醇倍比
          色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法考察 SYHA1809 的药动
                                                              稀释，得到质量浓度分别为 400、200、80.0、40.0、10.0、
          学行为，以期为该新药的临床应用提供参考。
                                                              2.00、0.800、0.400 μg/mL的系列标准溶液。另精密吸取
          1 材料
                                                              SYHA1809 储备液适量，以 50% 甲醇稀释，得到质量浓
          1.1 主要仪器
                                                              度分别为320、160、1.20、0.400 μg/mL的质控（QC）溶液。
              本研究所用主要仪器有TSQ Quantum Vantage型三
                                                              2.3.3 内标溶液的配制
          重四极杆串联质谱仪（日本Shimadzu公司）、5804R型高
                                                                  精密吸取内标储备液，以 50% 甲醇稀释，即得质量
          速离心机（德国Eppendorf公司）、H-101型多功能漩涡混
                                                              浓度为1 000 ng/mL的内标溶液。
          合器（上海康禾光电仪器有限公司）、CPA225D型分析天
                                                              2.4 生物样品预处理
          平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 ]。                                   取 30 μL 比格犬血浆，加入 30 μL 内标溶液和 300
          1.2 主要药品与试剂                                         μL 乙腈，振摇 15 min，以 3 700 r/min 离心 15 min，取 1
              SYHA1809、罗沙司他（内标）对照品（批号分别为                      μL，按“2.1”“2.2”项下条件进样分析。
          20190412、H20190301，纯度均大于 99.0%）均由石药集                2.5 方法学验证
          团中奇制药技术（石家庄）有限公司提供；二甲基亚砜                                按照《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》                    [8]
         （DMSO）为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公                           和生物样品分析国际规范的有关要求                 [9―10] ，对比格犬血
          司；甲酸、乙酸铵均为色谱级，购自上海阿拉丁生化科技                           浆中 SYHA1809 的 LC-MS/MS 测定方法进行方法学验
          股份有限公司；水为娃哈哈纯净水。                                    证，包括方法的专属性、准确度与精密度、残留效应、提
          1.3 动物                                              取回收率、基质效应、稀释效应以及稳定性考察。
              本研究所用动物为健康比格犬，体重为 6～12 kg，                      2.5.1 专属性考察
          共30只，雌雄各半，购自北京玛斯生物技术有限公司，动                              采集 6 只比格犬给药前的血浆并混合，得到空白血
          物生产许可证号为 SCXK（京）2021-0002，合格证号为                     浆。取空白血浆适量，除不加内标外，其余按“2.4”项下
          110318210100027738，使用许可证号为SYXK（冀）2021-              方法处理，然后进样分析，得空白血浆样品色谱图（见图
          007。比格犬给药前禁食不少于12 h，自由饮水。                           1A）；取空白血浆适量，加内标同法处理，得空白血浆+内


          · 2086 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 17                            中国药房  2023年第34卷第17期
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