Page 39 - 《中国药房》2023年17期
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1.3 动物                                             GRα、GRβ 抗体（稀释比例均为 1∶500），4 ℃孵育过夜，
              本研究所用动物为SPF级BALB/c小鼠，雌雄各半，                     洗片后滴加荧光二抗（稀释比例 1∶1 000），复染淬灭后
          6～8周龄，体重（20±2） g，购自辽宁长生生物技术股份                      封片。在荧光显微镜下采集图像，于 200 倍放大倍数下
          有限公司，实验动物生产许可证号为 SCXK（辽）2020-                      计数每个视野中 GRα、GRβ 阳性细胞数（二者阳性表达
          0001。小鼠购入后饲养于SPF级标准动物室内，室内温                        均呈绿色荧光），同一张切片计数5个视野，计数平均每
          度为（24±2） ℃，相对湿度为（50±10）%，保持昼夜节律                    个视野中的阳性细胞数，作为该样本的阳性细胞数进行
          交替。饲养期间食用标准饲料，常规适应性饲养 7 d。                         结果分析。
          本实验方案已通过包头医学院动物伦理委员会批准（批                           2.4.2 耳部皮肤组织中GRα、GRβ蛋白表达水平检测
          准号为2022第59号）。                                          取小鼠左耳部皮肤组织，采用组织匀浆细胞裂解法
          2 方法                                               提取核蛋白和总蛋白，采用 Western blot 法检测核蛋白
          2.1 动物分组、造模与给药                                     中 GRα 蛋白表达水平及总蛋白中 GRβ 蛋白表达水平。
              将50只小鼠按照随机数字表法分为5组，即正常对                        以 BCA 法测定蛋白浓度，用裂解液调整蛋白浓度至
          照组（A组）、模型组（B组）、地塞米松干预组（阳性对照，                       6.25 mg/mL，沸水浴中变性5 min。取50 μg变性后的蛋
          C组）、沙棘果油干预组（D组）、地塞米松+沙棘果油干预                        白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（在 80 V
          组（E 组），每组 10 只。除 A 组外，其余各组均采用                      电压下电泳 30 min，然后调整电压至 120 V 继续电泳
          DNCB+葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，        120 min），湿法转膜（电压 70 V，转膜时间 70 min），以
          SEB）法制备AD小鼠模型。具体造模方法是在文献[12]                       5%BSA封闭1 h；分别加入GRα、GRβ、GAPDH抗体（稀
          的基础上改进的：实验第1天，给所有小鼠背部皮肤做除                          释比例均为1∶500），4 ℃孵育过夜；次日室温复温1 h，以
          毛处理（除毛面积约 2 cm×3 cm）；于实验第 1、3、5 天，                 TBST 清洗 5 min×6 次，加入二抗（稀释比例 1∶1 000），
          使用 2.5%SEB 溶液（20 μL）、1%DNCB 溶液（200 μL）涂            室温孵育 2 h；再以 TBST 清洗 5 min×6 次，加入 ECL 发
          抹于B、C、D、E组小鼠背部皮肤，每天1次，共3次；自实                       光液，采用凝胶成像系统曝光显影，并用系统自带的软
          验第 7 天起，使用 2.5%SEB 溶液（20 μL）、0.5%DNCB 溶            件测定条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋
          液（20 μL）涂抹于 B、C、D、E 组小鼠左耳部皮肤处进行                    白（GAPDH）条带灰度值的比值作为该样本中目的蛋白
          激发，每 3 天激发 1 次，共 10 次。自实验第 7 天起，分别                 的相对表达水平。
          使用地塞米松（1.5 mg/kg，剂量根据文献[13]设置）和/或                  2.5 耳部皮肤组织中 AKT/S6K1 信号通路相关蛋白表
                           [12]
          沙棘果油（10 mL/kg） 对C、D、E组小鼠进行灌胃，每天                    达的检测
          1次，连续28 d。实验第35天，麻醉取血后处死小鼠（取                           采用 Western blot 法检测。取小鼠左耳部皮肤组
          血处死前，肉眼观察所有小鼠左耳部皮肤外观），取各组                          织，采用组织匀浆细胞裂解法提取总蛋白，具体方法及
          小鼠眼眶血，在 4 ℃下以 4 000×g 离心 10 min，取上清                步骤同“2.4.2”项下。其中，Gαi1、Gαi3、S6K1、p-S6K1、
          置于－80 ℃冰箱中冻存。                                      AKT1/2、p-AKT 一抗的稀释比例均为 1∶500，二抗的稀
          2.2 病理组织学观察                                        释比例为1∶1 000。
              取部分小鼠左耳部皮肤组织，用4%多聚甲醛固定，                        2.6 统计学方法
          经脱水、透明、浸蜡等常规步骤处理后，制作蜡块并切片                              采用SPSS 26.0软件进行统计分析。符合正态分布且
         （厚度为 5 μm）。常规行苏木素-伊红（HE）染色后在显                       方差齐的数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分
          微镜下观察各组小鼠左耳部皮肤组织形态特点，并测量                           析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          各组小鼠左耳部皮肤表皮层厚度。                                    3 结果
          2.3 血清中IgE、IL-4水平的检测                               3.1 小鼠左耳外观及耳组织病理学观察结果
              采用 ELISA 法检测。取“2.1”项下冻存血清，常规                       A组小鼠左耳部皮肤外观无明显红肿等炎症表现；
          解冻处理后，按相应试剂盒说明书方法操作，检测各组                           显微镜下显示该组小鼠左耳部皮肤表皮层细胞层次清
          小鼠血清中IgE、IL-4水平。                                   晰、排列规整，真皮层无明显血管扩张及炎症细胞浸润。
          2.4 耳部皮肤组织中GRα、GRβ表达的检测                            B组小鼠左耳部皮肤红肿、增厚、脱屑，部分区域溃烂；显
          2.4.1 耳部皮肤组织中GRα、GRβ阳性细胞数检测                        微镜下显示该组小鼠左耳部皮肤表皮层明显增厚，角化
              采用免疫荧光单标法检测。取小鼠左耳部皮肤组                          过度伴角化不全，真皮层血管扩张，大量炎症细胞浸润。
          织，放入 4% 多聚甲醛中固定 8 h，经脱水、透明、浸蜡等                     C、D组小鼠的左耳部皮肤红肿程度、过度角化现象及炎
          常规步骤处理后，制作石蜡切片（厚度为5 μm），经二甲                        症细胞浸润程度相较于B组均明显减轻。E组小鼠的左
          苯及梯度乙醇脱蜡、抗原修复后，以 5% 牛血清白蛋白                         耳部皮肤炎症表现趋于消退，过度角化现象消失，炎症
         （albumin from bovine serum，BSA）封闭 1 h，分别滴加          细胞浸润极少。结果见图1（C、D组图略）。


          中国药房  2023年第34卷第17期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 17    · 2081 ·
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