Page 31 - 《中国药房》2023年16期
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公司；兔源核因子 κB p65（nuclear factor kappa B p65， 2.5 大鼠血清生化指标检测
NF-κB p65）抗体、HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗（货号分 取－80 ℃下保存的血清样品，按相关试剂盒说明书
别为 8242T、7074S）均购自美国 Cell Signaling Technology 操作，以酶标仪检测各组大鼠血清中肝功能指标（AST、
公司。 ALT、ALP、TBA、DBIL、TBIL）含 量 和 氧 化 应 激 指 标
1.3 实验动物 （MDA、GSH、SOD）水平。
2.6 大鼠肝组织病理形态观察
SPF级雄性Wistar大鼠，体重（200±20）g，购自新疆
取固定于4%多聚甲醛中的肝组织适量，脱水，常规
医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号为
石蜡包埋，切片（厚度 4～5 μm），经 HE 染色后，置于显
SCXK（新）2018-0002。所有大鼠均饲养于受控环境（温
微镜下观察各组大鼠肝组织的病理形态变化。
度 23～24 ℃，相对湿度 50%～60%，光照/黑暗循环 12
2.7 大鼠肝组织中炎症和 FXR 信号通路相关因子
h）中，适应性喂养1周开始后续实验。本实验方案经新
mRNA表达检测
疆医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准，批
采用实时定量PCR法进行检测。取－80 ℃下保存
准号为IACUC-20180222-62。
的肝组织适量，用 Trizol 试剂提取总 RNA（50 mg）并将
2 方法 其反转录为 cDNA；以上述 cDNA 为模板，进行 PCR 扩
2.1 HBF药液的制备 增。反应体系（20 µL）包括：正、反引物各 0.8 µL，TB
参照HBF原方组成，称取芹菜根、菊苣子、茴香根皮 Green Premix Ex Taq（2×）10 µL，ROX Reference Dye 2
各 212 g，芹菜子、菊苣根、小茴香各 106 g，菟丝子 53 g， （50×）0.4 µL，cDNA 模板 2 µL，灭菌水6 µL。反应程序
粉碎，混合，加水煎煮 3 次，煎煮时间分别为 2、1.5、1 h； 为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，
合并3次煎液，浓缩得到干浸膏233.2 g，得率为23.16%。 72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶
给药前，用水溶解，制成不同浓度的HBF药液，备用。 （GAPDH）为内参，采用 2 －ΔΔCt 法计算各组大鼠肝组织中
2.2 分组、给药与造模 炎症相关因子[肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，
将大鼠随机分为对照组（control组）、模型组（model TNF-α）、白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）]和 FXR
信号通路相关因子[FXR、小异源二聚体伴侣受体（small
组）、UDCA组（阳性对照，60 mg/kg）和HBF低、中、高剂
heterodimer partner，SHP）、NTCP、有机阴离子转运多肽
量组[HBF-L、HBF-M、HBF-H 组，0.4、0.8、1.6 g/kg（按生
2（organic anion-transporting polypeptide 2，OATP2）、
药总量计）]，每组 6 只。UDCA 的剂量参考相关文献 [10]
BSEP、MRP2、胆固醇7α羟化酶（cholesterol 7α-hydroxy‐
设置；HBF的临床人用剂量为18 g/d，折算得大鼠中剂量
lase，CYP7A1）]mRNA 的表达水平，结果以 control 组为
为 0.8 g/kg，再以此为基础得低、高剂量分别为 0.4、1.6
参照进行归一化处理。引物由生工生物工程（上海）股
g/kg。各药物组大鼠每天灌胃相应药液 1 次，连续 7 d；
份有限公司设计、合成，引物序列及产物长度见表1。
control组和model组大鼠灌胃等体积水。所有大鼠在造
表1 PCR扩增引物序列及产物长度
模前均禁食不禁水12 h；实验第5天，除control组大鼠灌 基因 引物序列（5′→3′） 产物长度/bp
胃等体积橄榄油外，其余各组大鼠均单次灌胃 ANIT 橄 TNF-α 上游：GACTGGCGTGTTCATCCG 180
下游：TCTGAGCATCGTAGTTGTTGG
榄油溶液（100 mg/kg）建立肝内胆汁淤积性肝损伤 IL-1β 上游：TGATGACGACCTGCTAGTGTG 124
模型 [2，11] 。 下游：TCCATTGAGGTGGAGAGCTT
FXR 上游：AACCCCGATGTTTAGTTTCT 129
2.3 大鼠生理状况观察
下游：TCCACTGCCTCTCTATCCTT
实验期间，每天记录各组大鼠的死亡情况，以及尿 SHP 上游：CTCGGTTTGCATACAGTGTTTGC 75
下游：GCATATTGGCCTGGAGGTTTT
色、脱毛、精神状态等生理状况的变化情况。
NTCP 上游：CCACTTTTCTTCTTTCCTCTCCTCT 124
2.4 标本采集与处理 下游：GGTCCTTTGGAGGCTTGATTT
实验第7天末次给药（即ANIT造模48 h）后，麻醉大 OATP2 上游：TGTGATGACCGTTGATAATTTTCCA 81
下游：TTCTCCACATATAGTTGGTGCTGAA
鼠并于腹主动脉取血，以 3 000 r/min 离心 10 min，收集 BSEP 上游：TGGTTTCAAGGCAATGTTAGG 99
上层血清，于－80 ℃下保存，用于血清生化指标的检测。 下游：TGGGAAGCATCTGTAGCAAG
MRP2 上游：TTGGTCGTCTTCTGTTCC 150
随后，处死各组大鼠，取一部分肝组织固定在4%多聚甲 下游：AATGTTGGTCTCTGCTTCTG
醛中，用于组织病理形态观察；其余肝组织立即冻存于 CYP7A1 上游：CACTTGTTCAAGACCGCACA 189
下游：TGCTTGAGATGCCCAGAGAA
液氮中，于－80 ℃下保存，用于相关蛋白及 mRNA 的
GAPDH 上游：GTGCCAGCCTCGTCTCATAG 98
检测。 下游：GAACTTGCCGTGGGTAGAGT
中国药房 2023年第34卷第16期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 16 · 1945 ·
