Page 60 - 《中国药房》2023年12期
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试剂盒（含相应裂解液、磁珠等，批号 17-700）购自美国                       2.3 正常细胞、亲本细胞、耐药细胞中 LncRNA NNT-
          Millipore 公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂             AS1表达水平的检测
          盒（批号 MA0220）购自大连美仑生物技术有限公司；兔                            采 用 qRT-PCR 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的
          抗人HMGB2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体和辣                      BEAS-2B、A549 和 A549/TAX 细胞，以每孔 2.5×10 个、
                                                                                                         4
          根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号分别为                          每孔1 mL接种于24孔板中，常规培养48 h。收集细胞，
          ab124670、ab181602、ab6721）均购自英国 Abcam 公司；            采用TRIzol试剂提取3种细胞的总RNA，待测定其纯度
          RPMI-1640培养液（批号31800-022）、Opti-MEM Ⅰ培养              和浓度后，将其逆转录为cDNA。以上述cDNA为模板，
          基（批号11058021）均购自美国Gibco公司。                          进行 PCR 扩增。反应体系包括 cDNA 模板 2 μL，上、下
          1.3 细胞与动物                                           游引物（引物序列及产物长度见表 1）各 1 μL，SYBR
              人正常肺上皮细胞系 BEAS-2B、人 NSCLC 细胞系                   Green Mix 10 μL，无菌 ddH2O2 6 μL。反应条件为 95 ℃
          A549 均由美国 ATCC 公司提供。所有细胞均接种于含                       预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 60 s，72 ℃延伸
          1% 青-链霉素双抗和 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养                  30  s，共 38 个 循 环 。 以 GAPDH 为 内 参 ，使 用 Roche
          液中，置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养，用 0.5% 胰蛋白                   LightCycler 480 软件以 2 －ΔΔCt 法计算 LncRNA NNT-AS1
          酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化传代（2～3 d 传代 1 次），                   的表达水平，结果以正常细胞为对照进行归一化处理。
          取对数生长期细胞进行后续实验。                                          表1 qRT-PCR实验的引物序列及产物长度
              12只SPF级雄性BALB/c裸鼠，7周龄，体质量20～                    基因       上游引物（5′→3′）      下游引物（5′→3′）     产物长度/bp
          22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物                         LncRNA NNT-AS1 ACGTGCAGACAACATCTACCT  TACAACACCTTCCCGCAT  279
                                                              GAPDH    CCTGCCGTCTAGAAAAACCTG  AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT  118
          生产许可证号为 SCXK（京）2019-0009。本动物实验程                     HMGB2    GCCAACAGGCTCAAAGAA  CACACATTCCACACGCA  119
          序符合《实验动物护理和使用指南》的相关要求，并经衡                           miR-582-5p  GCACACATTGAAGAGGACAGAC TATTGAAGGGGGTTCTGGTG  104
                                                              U6       CTCGCTTCGGCAGCACA  ACGCTTCACGAATTTGCGT  125
          水市人民医院伦理委员会批准（批准号为2020-2-026）。
                                                              2.4 miR-582-5p 与 LncRNA NNT-AS1、HMGB2 靶向
          2 方法
                                                              关系的验证
          2.1 TAX耐药细胞系的建立
                                                              2.4.1 双荧光素酶报告基因实验 使用Starbase在线生
              采用逐步增加剂量、间歇给药的方法诱导TAX耐药
                                                              物信息学工具预测 miR-582-5p 与 LncRNA NNT-AS1、
          细胞系（A549/TAX），具体操作如下：取对数生长期的亲
                                  4
          本 A549 细胞，以每孔 3×10 个、每孔 1 mL 接种于 24 孔               HMGB2 的潜在结合位点。将预测的 LncRNA NNT-
                                                              AS1、HMGB2 序列片段和突变片段分别插入到荧光素
          板中，在含0.1 μg/mL TAX的培养液中培养48 h，接着更
                                                              酶报告基因载体中，构建野生型载体（LncRNA NNT-
          换不含TAX的培养液，待细胞稳定生长、传代后，逐步增
                                                              AS1-WT、HMGB2-WT）和突变型载体（LncRNA NNT-
          加培养液中 TAX 的质量浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0……
          5.0 μg/mL），继续培养。经过约6个月的诱导，细胞能在                      AS1-MUT、HMGB2-MUT）。将所构建的野生型载体和
          含 5.0 μg/mL TAX 的培养液中稳定生长和传代，此细胞                    突变型载体分别和miR-582-5p mimic或miR-NC共转染
          即A549/TAX细胞 。                                       至 A549/TAX 细胞，48 h 后，收集细胞，参照双荧光素酶
                          [14]
          2.2 亲本细胞、耐药细胞对TAX敏感性的检测                             报告基因检测试剂盒说明书方法使用酶标仪检测荧光
              采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的A549和                       素酶的活性。
          A549/TAX 细胞，以每孔 2×10 个、每孔 100 μL 接种于                2.4.2 RNA pull-down 实验 将 Bio-miR-582-5p 和 Bio-
                                    3
          96孔板中，待细胞贴壁后，加入适量TAX（最终质量浓度                         miR-NC转染至A549/TAX细胞，48 h后，收集细胞，加入
          分别为0、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL，质量浓度参考相关                RNA pull-down裂解液裂解，将裂解产物与经酵母tRNA
              [15]
          文献 并加以调整，每质量浓度设置 3 个复孔），在                           提前包被的M280链霉素亲和磁珠于4 ℃下共孵育4 h；
          37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h；随后，每孔添加CCK-8                   磁珠经洗涤后，使用 TRIzol 试剂提取其结合的 RNA，采
          试剂10 μL，继续培养2 h；使用酶标仪于450 nm波长处                     用 qRT-PCR 法检测细胞中 LncRNA NNT-AS1 的表达水
          检测各孔的光密度（OD）值并计算细胞存活率、TAX 抑                         平。具体操作参照“2.3”项，结果以 Bio-miR-NC 转染细
          制细胞增殖的半数抑制浓度（IC50 ）和耐药倍数。细胞存                        胞为对照进行归一化处理。
          活率（%）＝经某质量浓度 TAX 处理细胞的 OD 值/经 0                     2.4.3 RIP实验 采用RIP裂解液裂解A549/TAX细胞，
          μg/mL TAX处理细胞的OD值×100%；耐药倍数＝耐药                      将裂解产物与含有 Argonaute2（Ago2）抗体或 IgG 抗体
          细胞的IC50/亲本细胞的IC50。                                  的磁珠于 4 ℃下共孵育过夜；磁珠经洗涤后，使用


          · 1462 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 12                            中国药房  2023年第34卷第12期
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