Page 61 - 《中国药房》2023年12期

TRIzol试剂提取其结合的RNA，采用qRT-PCR法检测细 显微镜观察并记录细胞个数≥50的单克隆菌落数，即克
胞中 LncRNA NNT-AS1 和 miR-582-5p 的表达水平。具 隆形成数。
体操作参照“2.3”项，结果以含IgG抗体的细胞为对照进 2.5.5 细胞凋亡率的检测 采用流式细胞术进行检测。
行归一化处理。 转染 48 h 后，收集各组细胞，用 PBS 洗涤后以 binding
2.5 体外细胞验证实验 buffer 195 μL 重悬，随后加入 Annexin Ⅴ-FITC 试剂 5
2.5.1 细胞分组、转染及下游基因表达的检测 取对数 μL 和 PI 染色液 10 μL，避光孵育 15 min 后，使用流式细
生长期的 A549/TAX 细胞，将其分为 si-NC 组（转染 si- 胞仪检测各组细胞的凋亡率。
NC）、si-LncRNA NNT-AS1 组（转 染 si-LncRNA NNT- 2.6 裸鼠成瘤验证实验
AS1）、si-LncRNA NNT-AS1+anti-NC 组（共 转 染 si- 将 裸 鼠 适 应 性 饲 养 2 周 后 ，分 为 sh-NC 组 、sh-
LncRNA NNT-AS1 和 anti-NC）、si-LncRNA NNT-AS1+
LncRNA NNT-AS1 组，每组 6 只。各组裸鼠分别皮下注
anti-miR-582-5p 组（共转染 si-LncRNA NNT-AS1 和 anti-
射 A549/TAX 细 胞 悬 液（已 稳 定 转 染 sh-NC 或 sh-
miR-582-5p），每组设 3 个复孔。采用脂质体 2000 转染
LncRNA NNT-AS1，细 胞 密 度 为 2×10 个/mL）200
7
试剂（每1 μL转染试剂用Opti-MEM Ⅰ培养基50 μL稀 [16]
μL 。注射后，于每周检测其肿瘤体积：肿瘤体积＝
释）分别将相应质粒（每 5 μg 质粒用 Opti-MEM Ⅰ培养
（长×宽×宽）/2。皮下注射 5 周后，裸鼠经麻醉后脱臼
基50 μL稀释）转染至各组细胞，48 h后，收集细胞，采用
处死，取出肿瘤组织，称定质量后，提取其总 RNA 和蛋
qRT-PCR 法检测各组细胞中 LncRNA NNT-AS1、miR-
白，分别采用qRT-PCR法和Western blot法检测LncRNA
582-5p 和 HMGB2 mRNA 的表达水平，以验证转染效果
NNT-AS1、miR-582-5p、HMGB2 mRNA及蛋白的表达水
及 LncRNA NNT-AS1 对下游基因表达的影响。具体操
平。具体操作同“2.3”“2.5.2”项，LncRNA NNT-AS1、
作同“2.3”项，其中 LncRNA NNT-AS1、HMGB2 mRNA
miR-582-5p、HMGB2 mRNA 的表达水平以 sh-NC 组为
以 GAPDH 为内参，miR-582-5p 以 U6 为内参，结果均以
对照进行归一化处理。
si-NC组为对照进行归一化处理。
2.7 统计学方法
2.5.2 细胞中 HMGB2 蛋白表达的检测 采用 Western
采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量数
blot法进行检测。转染48 h后，收集各组细胞，于冰上裂
据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间
解后离心以提取总蛋白，采用 BCA 法对蛋白浓度进行
定量，再对蛋白进行变性处理。取变性蛋白20 μg，进行 比较采用单因素方差分析，组间有差异者进一步采用
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转至 SNK-q检验进行两两比较。检验水准α＝0.05。
聚偏氟乙烯膜上，以 5% 牛血清白蛋白室温封闭 1 h；加 3 结果
入HMGB2、GAPDH一抗（稀释度1∶10 000），于4 ℃孵育 3.1 亲本细胞、耐药细胞对TAX的敏感性
过夜；以PBST洗涤后，加入相应二抗（稀释度1∶5 000）， 与 0 μg/mL 的 TAX 比较，4、8、16、32、64 μg/mL 的
室温孵育 30 min；以 PBST 洗涤后，用 ECL 显色，使用凝 TAX 均可显著降低 A549 细胞的存活率（P＜0.05），16、
胶成像分析系统成像并使用 Image J 软件分析，以目标 32、64 μg/mL的TAX均可显著降低A549/TAX细胞的存
蛋白与内参蛋白（GAPDH）的条带灰度值比值表示目标 活率（P＜0.05），详见图 1。经计算，TAX 对 A549 细胞、
蛋白的表达水平。 A549/TAX细胞的IC50分别为8.75、57.63 μg/mL，耐药倍
2.5.3 细胞活力的检测 采用 CCK-8 法进行检测。转 数为6.59。
染 48 h 后，收集各组细胞并以每孔 2×10 个、每孔 100 150 A549
3
μL 接种至 96 孔板中，于 37 ℃、5%CO2下分别培养 24、 A549/TAX
48、72 h 后，每孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，孵育 2 h；使用 100 a
酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔细胞的 OD 值以判断 细胞存活率/% a a a
其活力（OD值与细胞活力成正比）。 50 a a a
a
2.5.4 细胞克隆形成能力的检测 采用克隆形成实验
0
进行检测。转染48 h后，收集各组细胞并以每孔800个、 0 10 20 30 40 50 60 70
TAX质量浓度/（μg/mL）
每孔2 mL接种至6孔板中，于37 ℃、5%CO2下培养2周 a：与0 μg/mL TAX比较，P＜0.05
（2～3 d 换液 1 次并观察细胞状态），当出现肉眼可见的 图1 不同质量浓度 TAX 干预后 A549 和 A549/TAX 细
克隆菌落时终止培养，用甲醇固定、结晶紫染色后，使用 胞的存活率（x±s，n＝3）

中国药房 2023年第34卷第12期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 12 · 1463 ·