Page 55 - 《中国药房》2023年12期
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1 材料                                               2.3 细胞活性检测
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          1.1 主要仪器                                               取对数生长期的Chang Liver细胞，以5×10 个/L接
              本研究所用主要仪器包括Ts2-FL型倒置显微镜（日                      种于 6 孔板中，每孔 100 μL，待细胞密度达 80%～90%
                                                                                      7
          本 Nikon 公 司），PowerPac  200 型 蛋 白 垂 直 电 泳 仪 、       时，将细胞消化计数，按8×10 个/L接种于96孔板中，培
          ChemiDoc Touch型化学发光成像系统、680型酶标仪（美                  养至细胞达 60% 融合时，按“2.2”项下方法分组、给药、
          国Bio-Rad公司），QuantStudio 1型荧光定量聚合酶链式                培养，每组设8个复孔。待细胞培养结束后，按CCK8试
                                                             剂盒说明书操作，用酶标仪检测450 nm波长处的光密度
          反应（PCR）仪（美国ABI公司）等。
                                                            （optical density，OD），计算细胞存活率。细胞存活率＝
          1.2 主要药品与试剂
                                                             实验组平均OD值/空白组平均OD值×100%。
              苦参碱原料药（纯度≥98%，批号X05J6M6）购自上
                                                             2.4 细胞内脂滴观察及脂质含量测定
          海源叶生物科技有限公司；油红 O（批号 O405866）购自
                                                                 按“2.3”项下方法取细胞，分组、给药、培养，每组设
          上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白酶（批号
                                                             8个复孔。待细胞培养结束后，弃培养基，用预热的磷酸
          0457）购 自 美 国 Amresco 公 司 ；CCK8 试 剂 盒（批 号
                                                             盐缓冲液（PBS）清洗 3 次，加入 4% 多聚甲醛固定 30
          ab228554）购自阿达玛斯试剂有限公司；Total RNA提取
                                                             min，以 60% 异丙醇溶液漂洗数秒，用油红 O 避光染色
          试剂（批号 9109）购自日本 Takara 公司；逆转录试剂盒                   30 min，再用 60% 异丙醇溶液分色，苏木精复染，PBS 漂
         （gDNA 清 除 剂）、NovoStart®  SYBR  qPCR  SuperMix       洗，甘油明胶封片，用倒置显微镜观察脂滴形态并拍照。
          Plus（批号分别为E047-01A、E096-01B）均购自创亚化工                取上述经油红 O 处理后的细胞，每孔加入异丙醇 200
         （上海）有限公司；兔源FXR抗体、小鼠源甘油醛-3-磷酸                        μL，孵育 15 min 后抽提，取抽提液 200 μL 加入 96 孔板
          脱 氢 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate  dehydrogenase，  中，用酶标仪检测 490 nm 波长处的 OD 值，计算相对脂
          GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG                       质含量。相对脂质含量＝实验组平均 OD 值/空白组平
         （H+L）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）（批                      均OD值×100%。
          号分别为 13194-1-AP、60004-I-Ig、SA00001-1、SA00001-      2.5 细胞中肝功能指标检测
          2）均购自美国Proteintech公司；兔源FGF19、CYP7A1抗                   按“2.3”项下方法取细胞，分组、给药、培养，每组设
          体（批号分别为 PB1116、A01601）均购自博士德生化科                    3个复孔。待细胞培养结束后，取培养液，按试剂盒说明
          技有限公司；人丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，            书操作，检测其中ALT、AST、TBIL、ALP的含量。
          ALT）、天 冬 氨 酸 转 氨 酶（aspartate  aminotransferase，    2.6 细胞中FXR、CYP7A1、FGF19 mRNA表达检测
          AST）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、碱性磷酸酶（al‐              按“2.3”项下方法取细胞，分组、给药、培养，每组设
          kaline phosphatase，ALP）酶联免疫吸附试验（ELISA）试            3 个复孔。待细胞培养结束后，取各组细胞，弃培养液，
                                                             用 PBS 清洗 2 次，加入 1 mL 的 Total RNA 提取试剂，吹
          剂盒（批号分别为JL45974、JL12187、JL20094、JL13265）
                                                             打混匀，室温放置 5 min，移至离心管中，加入氯仿 200
          均购自上海江莱生物科技有限公司；其余试剂均为分析
                                                             µL，充分混匀，室温静置 5 min，离心 12 min（4 ℃下，转
          纯或实验室常用规格。
                                                             速12 000 r/min，下同）。取400 µL上清液至新的离心管
          1.3 细胞
                                                             中，加入异丙醇 400 µL，混匀，－20 ℃下放置 15 min，离
              人正常肝细胞系 Chang Liver 由武汉塞维尔生物科
                                                             心10 min，弃上清液，静置，加入1 mL预冷的75%乙醇，
          技有限公司提供，货号SE0021。
                                                             离心 5 min，弃上清液，加入 20 µL ddH2O，充分溶解
          2 方法
                                                             RNA，测定RNA浓度及纯度后，逆转录成cDNA，并进行
          2.1 细胞培养                                           PCR 扩增。反应体系为：2×qPCR SuperMix Plus 12.5
              Chang Liver细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL              μL，7.5 μmol/L 基因引物 2.0 μL，逆转录产物 2.5 μL，
          青霉素、100 g/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中，于                 ddH2O 8.0 μL。扩增条件为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变
          37 ℃、5%CO2下培养，待细胞融合至80%左右开始传代。                     性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以
          2.2 细胞分组与给药                                        GAPDH 为 内 参 ，采 用 2     －ΔΔCT  法 计 算 细 胞 中 FXR、
              将细胞分为空白组、模型组和苦参碱低、中、高浓度                        CYP7A1、FGF19 mRNA 的表达水平。引物由福州尚亚
          组。空白组不进行干预；模型组细胞饥饿 24 h 后加入                        生物技术有限公司合成，序列和产物大小见表1。
                                 [9]
          1.0 mmol/L油酸（根据文献 和预实验结果得到）继续培                                 表1 引物序列与产物大小
          养24 h建立脂肪变性细胞模型；苦参碱低、中、高浓度组                         基因   上游引物（5′-3′）       下游引物（5′-3′）       产物大小/bp
          细胞先按模型组方法建模后再加入 0.1、0.5、1.0 mmol/L                  GAPDH  AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC  TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT  113
                                                              FXR  CAGGAGCCACTTCTTGATGT  TGGTGATGATTGAATGTCCGTAA  119
          苦参碱溶液（用二甲基亚砜配成 2 mmol/L 的母液，临用                      CYP7A1  TCTACCCAGACCCTTTGACTTT  GCGAACAATCTTCCAGGACATAT  151
                                  [10]
          前用生理盐水制成所需溶液 ）继续培养24 h。                             FGF19  CAATGTGTACCGATCCGAGAAG  TGGGCAGGAAATGAGAGAGT  110

          中国药房  2023年第34卷第12期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 12    · 1457 ·
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