Page 31 - 《中国药房》2023年12期
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件下每孔加入培养基稀释的CCK-8试剂100 μL，在培养                      RIPA细胞裂解液100 μＬ提取细胞总蛋白，于冰浴中放
          箱中孵育2 h，于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）                     置 30 min，于 4 ℃下以 1 500 r/min 离心 15 min；取上清
          值，并计算细胞存活率。细胞存活率的计算公式如下：                           液，采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白煮沸变性，取变
          细胞存活率＝（实验组 OD 值－空白组 OD 值）/（对照组                     性蛋白样品 50 μg，以 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
          OD值－空白组OD值）×100%。                                  胺凝胶电泳分离并转至聚偏二氟乙烯膜上，用含50 g/L
          2.4 LDH、SOD活性和MDA含量检测                              脱脂奶粉的 TBST缓冲液封闭 1 h，加入 cleaved caspase-
              取对数生长期且状态良好的 RN-C 细胞，调整密度                      3、Bcl-2、Bax、β-actin 一抗（稀释比例分别为 1∶3 000、
                 6
          至 1×10 个/mL，按 2 mL/孔接种于 6 孔板中，随机分为                 1∶2 000、1∶500、1∶2 000），于4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲
          对照组、缺氧组、黄芩素组（0.1 μmol/L，根据“2.3”项下                  液反复洗膜3次，室温下加入二抗（稀释比例为1∶5 000）
          筛选的药物浓度结果设置），每组设置 6 个复孔。按                          孵育 1 h；用 TBST 缓冲液反复洗膜 3 次，显影、扫描图
         “2.3”项下方法培养 24 h，收集细胞和上清液，按照各试                      像，将胶片拍照后用凝胶图像处理系统分析，实验重复3
          剂盒说明书检测各组细胞上清液中LDH的活性，细胞中                          次。用 Image J 软件分析各条带灰度值，以 β-actin 作为
          MDA的含量和SOD的活性。                                     内参，检测各组cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的相对
          2.5 细胞迁移率检测                                        表达量（蛋白相对表达量＝目的蛋白条带灰度值/内参条
              采用划痕实验进行检测。将对数生长期的细胞调                          带灰度值），并计算Bcl-2与Bax表达水平的比值。
                       5
          整密度至3×10 个/mL，按2 mL/孔接种至6孔板中。随                     2.8 统计学方法
          机分为对照组、缺氧组和黄芩素组，处理方式同“2.4”                             用 GraphPad Prism 9.0 软件进行数据统计分析。数
          项下。用无菌枪头在孔底垂直标记划痕线，用 PBS 清                         据均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
          洗 2 次，拍照记录划痕后 0、24 h 时的划痕愈合情况；                     间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          用 Image J 软件计算划痕面积，并计算细胞迁移率。细                      3 结果
          胞迁移率的计算公式如下：细胞迁移率（%）＝（S0－S24 ）/                    3.1 不同浓度黄芩素对缺氧RN-C细胞存活率的影响
          S0×100%，式中，S0、S24分别指0、24 h时的划痕面积。                      结果如图 1 所示，经缺氧处理后细胞存活率显著下
          2.6 细胞凋亡率和细胞周期检测                                   降（P＜0.01）；与缺氧组细胞比较，0.01、0.1、1 μmol/L 黄
          2.6.1 细胞凋亡率 采用 Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染流               芩素处理组细胞存活率均显著升高（P＜0.05 或 P＜
          式细胞术检测。取对数生长期的 RN-C 细胞，以 1×10                  5   0.01），提示上述浓度黄芩素可逆转缺氧处理后细胞存活
          个/mL接种于6孔板中，按“2.4”项下方法分组处理、培养                      率降低的现象，且 0.1 μmol/L 黄芩素效果最佳，故选择
          24 h，每组设置 3 个复孔。对细胞进行消化和收集，用                       该浓度进行后续实验。
          PBS洗涤后以1 500 r/min离心5 min，收集各组细胞于离                          100             c
          心管中，用 400 μL 1×binding buffer 重悬制成密度为                        80      a   b      b
                                                                       70
          1×10 个/mL 的 细 胞 悬 液 ；按 FITC 标 记 的 Annexin                   细胞存活率/% 90
               6
                                                                       60
          Ⅴ-FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，应用流                                  50
                                                                       40
                                                                       30
          式细胞仪检测细胞凋亡率。                                                 20
                                                                         对照组  缺氧组    0.01       0.1          1          10        100
          2.6.2 细胞周期 采用流式细胞术进行检测。分组、培                                                                    黄芩素浓度/（μmol/L）
          养方法同“2.6.1”项下，以 1 500 r/min离心 5 min，收集各               a：与对照组比较，P＜0.01；b：与缺氧组比较，P＜0.05；c：与缺氧组
          组细胞，用 PBS 洗涤 2 次后，将细胞分散于－20 ℃的                     比较，P＜0.01
                                                             图1 不同浓度黄芩素对缺氧RN-C细胞存活率的影响
          75% 乙醇中固定过夜；以 1 500 r/min 离心 5 min，收集细
                                                                  （x±s，n＝6）
          胞，用 PBS 洗涤 2 次后按 DNA 含量检测试剂盒（细胞周
          期）说明书进行操作，并应用流式细胞仪检测分析细胞                           3.2 黄芩素对缺氧 RN-C 细胞中 LDH、SOD 活性和
          周期的分布情况。                                           MDA含量的影响
          2.7 细胞中 cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表达影              与对照组比较，缺氧组细胞上清液中LDH 活性、细
          响的检测                                               胞中 MDA 含量均显著升高，SOD 活性显著降低（P＜
              采用Western blot方法进行检测。取RN-C细胞，按                 0.01）。与缺氧组比较，黄芩素组细胞上清液中 LDH 活
         “2.4”项下方法分组、处理、培养，每组设置3个复孔。收                        性和细胞中MDA含量均显著降低，细胞中SOD活性显
          集各组细胞，用 PBS 洗涤 2 次，离心，弃上清液，加入                      著升高（P＜0.01）。结果见表1。


          中国药房  2023年第34卷第12期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 12    · 1433 ·
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