Page 36 - 《中国药房》2023年12期
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          段，在癌症的预防和治疗中具有重要作用 。                                胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、C/Ebp-同源蛋白
              钩吻 Gelsemium elegans（Gardn.et Champ.）Benth. 为  （C/EBP-homologous protein，CHOP）抗体（货号分别为
          马钱科植物胡蔓藤的全草，又名胡蔓藤、断肠草、大茶药                           17447、2895）和兔源β-肌动蛋白（β-actin）、磷酸化Akt（p-
          等，始载于《神农本草经》，味辛、苦，性温，有大毒，民间                         Akt）（Thr308）、p-Akt（Ser473）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2-
                                            [3]
          常用作治疗风湿痹痛、神经痛、水肿等症 。现代研究表                           related X protein，Bax）、免疫球蛋白结合蛋白质（immu‐
          明，钩吻具有较好的抗肿瘤、抗感染、抗炎镇痛、调节免                           noglobulin binding protein，Bip）、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ
          疫等药理作用      [4―5] ，生物碱类成分为其主要活性成分，如                （microtubule-associated protein 1 light chain 3 Ⅱ，LC3Ⅱ）、
          钩吻素子、钩吻素甲、常绿钩吻碱（sempervirine，SPV）                   生存素抗体（货号分别为 4967、9275、9271、2772、3183、
          等 [6―8] 。研究发现，钩吻中的生物碱成分具有抗肝癌、结                      2775、2808）均购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记
          肠癌、食管癌的作用，对人结肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌                           的山羊抗兔IgG二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠
          细胞等也具有明显的抑制作用             [9―11] 。但钩吻中的生物碱          IgG二抗（货号分别为PR30011、PR30012）均购自武汉三
          单体成分种类较多，目前其抗肿瘤物质基础及作用机制                            鹰生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯；水为自制
          尚不明确。                                               超纯水。
              自噬和凋亡是两种不同的程序性细胞死亡方式，是                          1.3 细胞株
          维持细胞自我平衡的重要机制，在生物组织器官分化、                                人结肠癌HCT-8细胞株、人肺癌A549细胞株、人肝
          生长、发育、自我更新、疾病发生以及肿瘤形成中均有重                           癌HepG2细胞株、人肝癌Bel-7402细胞株均来源于中国
          要作用。已有研究证实，内质网应激（endoplasmic re‐                    科学院上海细胞库。
          ticulum stress，ERS）途径可引起细胞凋亡，抑制磷脂酰                  2 方法
          肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激     2.1 受试药物的制备
          酶 B（protein kinase B，Akt）信号通路也可抑制肿瘤细胞                   分别用二甲基亚砜溶液将 TA、SPV 配制成 500
          增 殖 并 诱 导 其 凋 亡    [12―13] 。 本 研 究 选 择 人 肝 癌 细 胞    μg/mL、200 μmol/L 的受试药物溶液，于 4 ℃保存待用，
         （HepG2、Bel-7402）、人肺癌细胞（A549）、人结肠癌细胞                  使用前用完全培养基稀释至相应浓度。
         （HCT-8）为受试细胞，观察并分析钩吻总生物碱（total                       2.2 细胞培养
          alkaloids of G. elegans，TA）和 SPV 对以上 4 种肿瘤细胞            用含 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素的 RPMI-
          的影响，并进一步推测其可能的作用机制，以期为钩吻                            1640培养基，将4种细胞均培养于37 ℃、5%CO2培养箱
          在肿瘤治疗领域的开发和应用提供依据。                                  中，待细胞生长达到对数生长期后用0.25%胰蛋白酶消
          1 材料                                                化、传代。
          1.1 主要仪器                                            2.3 细胞形态观察
                                                                                                      5
              本研究所用主要仪器包括GENios Pro型酶标仪（德                         取对数生长期的细胞消化后，分别以3×10 个/孔接
          国 Tecan 公司）、xCELLigence RTCA 型实时细胞分析仪               种至 6 孔板中，每孔加入 2 mL 相应的培养基，常规培养
         （美国 Agilent 公司）、Ⅸ70 型荧光倒置相差显微镜（日                     24 h使细胞贴壁后吸弃旧培养基，分别按低、中、高浓度
          本 Olympus 公司）、Universal Hood Ⅱ型化学发光成像               TA组（50、100、200 μg/mL，根据前期预实验结果确定浓
          系统（美国 Bio-Rad 公司）、Milli-Q 型超纯水系统（美国                 度）和低、中、高浓度 SPV 组（10、30、50 μmol/L，根据前
          Millipore公司）。                                       期预实验结果确定浓度）加药干预48 h，另设空白组（含
          1.2 主要药品与试剂                                         细胞不含药物），每组设3个复孔，用倒置相差显微镜观
              TA、SPV（纯度均不低于98%）均由福建中医药大学                      察细胞的形态变化。
          药学院 3408 实验室提供；紫杉醇（阳性对照药物，批号                        2.4 细胞毒性考察
          B21695，纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；                           取对数生长期的细胞悬液，加入相应的培养基稀
                                                                                  4
          磷 酸 盐 缓 冲 液（PBS）、双 抗 青 链 霉 素（货 号 分 别 为              释，使细胞密度为8×10 个/mL。取一块96孔板，按100
          SV30010、SV30010）均购自美国 HyClone 公司；RPMI-              μL/孔加入细胞培养基，除去背景，吸弃旧培养基；取各
          1640 不完全培养液、0.25% 胰蛋白酶（含乙二胺四乙                       细胞悬液分别接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h，
          酸）、胎牛血清（货号分别为 8122298、25200056、10099-               使细胞贴壁，吸弃旧培养基，分别按“2.3”项下低、中、高
          141）均购自美国 Gibco 公司；MTT（货号 M2128）购自美                 浓度 TA 组和低、中、高浓度 SPV 组加药继续培养 24 h，
          国 Sigma-Aldrich 公司；胱天蛋白酶 3（caspase-3）、cas‐          另设调零组（只含培养基）和空白组，每组设4个复孔，用
          pase-9 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（货号分别为                     xCELLigence系统动态监测48 h内的细胞生长情况。
          F00370、F00372）均购自上海西唐生物科技有限公司；                      2.5 细胞上清液中caspase-3、caspase-9含量检测
          BCA 蛋白定量分析试剂盒（货号 P0012）购自上海碧云                           取对数生长期的HCT-8细胞（经检测，TA和SPV对
          天生物技术有限公司；ECL 发光检测试剂盒（货号 S-                         HCT-8细胞的抑制效果最好），按“2.4”项下方法分组，加
          6010）购自西安宇恒生物科技开发有限公司；鼠源 B 细                        药，继续培养48 h，另设空白组和紫杉醇组（5 μmol/L，根


          · 1438 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 12                            中国药房  2023年第34卷第12期
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