Page 30 - 《中国药房》2023年12期
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损伤对缺氧相关疾病的防治具有重要意义                   [1―3] 。过去从     高糖培养基购自美国 HyClone 公司；胎牛血清（fetal bo‐
          天然药物中分离出的多种化合物被证实可以改善缺氧，                            vine serum，FBS）、青霉素-链霉素双抗均购自兰杰柯生
          如黄酮类化合物、生物碱多酚、皂苷、萜类和挥发油类化                           物科技有限公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，
                [4]
          合物等 。其中，黄芩素是黄芩属植物中丰富的黄酮类                            LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化
          化合物之一，能通过有抗氧化应激、抗炎症反应、抗神经                           酶（superoxide  dismutase，SOD）试 剂 盒（批 号 分 别 为

          细胞兴奋性毒性及抑制神经细胞凋亡和自噬等多种机                             20180728、20180728、20190412）均购自南京建成生物工
                                 [5]
          制发挥神经细胞保护作用 ，对神经退行性病变及其他                            程研究所；CCK-8细胞活力检测试剂盒（批号PM508）购
          中枢神经系统疾病均表现出较明显的预防和治疗作用，                            自日本Dojindo公司；DNA含量检测试剂盒（细胞周期）
          但是对于缺氧诱导的神经细胞损伤是否具有保护作用                            （批号 20210105）购自北京索莱宝科技有限公司；FITC
          尚不清楚。                                               标记的 Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（批号
              凋亡是一种由基因精确调控的程序性细胞死亡方                           10625-2）购自上海碧云天生物技术公司；兔Bcl-2多克隆
          式，过度或不充分的凋亡可能导致多种疾病的发生。研                            抗体（批号 bf9103）购自美国 Affinity 公司；兔 cleaved
                                                [6]
          究证实，缺氧可激活凋亡通路引起细胞损伤 ，其中B细                           caspase-3 多克隆抗体（批号 9664s）购自美国 Cell Signa-
          胞淋巴瘤 2 相关 X 蛋白（B-cell lymphoma-2 X protein，         ling Technology公司。
          Bax）是促凋亡蛋白，其与抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2（B-                        1.3 细胞
          cell lymphoma-2，Bcl-2）以二聚体的形式存在于细胞中，                    大鼠皮质神经元 RN-C 细胞，购于上海清奇生物
                                                        [7]
          二者之间的动态平衡对细胞凋亡的发生起关键作用 。                            公司。
          胱天蛋白酶3（caspase-3）是凋亡的效应因子，活化的cas‐                   2 方法
          pase-3（cleaved caspase-3）能分解细胞蛋白，起到凋亡执              2.1 RN-C细胞培养
          行器的作用。caspase-3/Bax/Bcl-2 通路是细胞凋亡发生                     将 RN-C 细 胞 接 种 于 DMEM 高 糖 培 养 基（含
                        [8]
          发展的重要途径 。基于此，本研究拟通过体外实验观                            10%FBS 和 1% 青霉素-链霉素）中，于 37 ℃、5%CO2和
          察黄芩素对缺氧大鼠皮质神经元细胞的保护作用；并以                            95% 相对饱和湿度的培养箱中培养。待细胞密度达
          caspase-3/Bax/Bcl-2 细胞凋亡通路为线索，探讨黄芩素                 80%～90%时，用0.25%胰酶消化1～2 min，用培养基终
          的作用机制，以期为抗缺氧药物的研究和应用提供理论                            止消化后按1∶3比例传代，待细胞长至对数生长期后进
          依据。                                                 行后续实验。
          1 材料                                                2.2 分组与处理
          1.1 主要仪器                                                将RN-C细胞随机分为对照组、缺氧组和黄芩素组。
              本研究所用主要仪器包括INC153H9T6型三气培养                      对照组细胞在正常培养条件下培养24 h；缺氧组细胞在
          箱（德国 Memmert 公司）、mic-101 型便携式细胞低氧小                  课题组前期实验确定的缺氧条件（即 5%CO2、94%N2、
          室（美国 Billups-Rothenberg 公司）、Spectra Max i3 型全       1%O2 ）下培养 24 h；黄芩素组细胞加入用培养基稀释的
          自动荧光酶标仪（美国 Molecular Devices 公司）、ACEA               相应浓度的黄芩素培养30 min后，再在上述缺氧条件下
          NovoCyte型流式细胞仪（美国ACEA Biosciences公司）、               培养24 h。
          CKX41 型倒置相差显微镜（日本 Olympus 公司）、EST-                  2.3 细胞存活率测定
          10-O2 型氧浓度测定仪（深圳市兴源恒通科技有限公                              采用 CCK-8 法对细胞存活率进行检测。取对数生
          司）、ChemiDoc MP 型凝胶成像分析系统（美国 Bio-Rad                 长期且状态良好的RN-C细胞，用0.25%胰酶消化后，分
          公司）等。                                               别按 1×10 个/孔的密度接种于 96 孔板，随机分为对照
                                                                       4
          1.2 主要药品与试剂                                         组、缺氧组、不同浓度的黄芩素组（100、10、1、0.1、0.01

              黄芩素标准品（批号 JPJYH-QJ，纯度＞98.0%）购自                  μmol/L），每组设置6个复孔。于37 ℃、5%CO2条件下培
          日本东京化成工业株式会社；BCA 蛋白定量检测试剂                           养 24 h 后，弃去旧培养基，对照组和缺氧组细胞加入新
          盒、兔抗鼠Bax单克隆抗体、鼠β-肌动蛋白（β-actin）单克                    培养基 100 μL，黄芩素组细胞分别加入含黄芩素 100、
          隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白                             10、1、0.1、0.01 μmol/L 的培养基 100 μL，同时设置不含
          G 二 抗（批 号 分 别 为 GB12690、GB15001、GB25301、            细胞、不含药物的培养基为空白组。按“2.2”项下培养方
          G2026）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；DMEM                         法处理细胞，继续培养24 h后，弃去旧培养基，于避光条


          · 1432 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 12                            中国药房  2023年第34卷第12期
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