Page 27 - 《中国药房》2023年12期

5%脱脂奶粉）中室温封闭2 h；用TBST缓冲液洗膜后加
入一抗[β-actin（稀释比例为 1∶50 000），TNF-α、PI3K、
Akt、p-Akt（稀释比例均为 1∶1 000）]，置于摇床上，于
4 ℃孵育过夜。用 TBST 缓冲液洗膜 5 min×4 次，加入
HRP-山羊抗兔 IgG 二抗（稀释比例为 1∶1 000），置于摇
A. CON组 B. MOD组
床上室温孵育 1 h；用 TBST 缓冲液洗膜 5 min×4 次，避
光添加显影液，在化学发光系统中拍照成像。用Image J
软件分析蛋白条带的灰度值，以 TNF-α、PI3K 蛋白与内
参蛋白β-actin条带灰度值的比值表示TNF-α、PI3K蛋白

C. POS组 D. GD组 的表达水平，以 p-Akt 蛋白与 Akt 蛋白条带灰度值的比
值表示 p-Akt 蛋白的表达水平。结果如图 3、表 4 所示。
相较于CON组，MOD组小鼠脾脏组织中TNF-α、PI3K、
p-Akt 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与 MOD 组
比较，各给药剂量组小鼠脾脏组织中 TNF-α、PI3K、p-
E. GG组 Akt蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。
图2 归脾丸对小鼠脾脏组织病理学的影响（HE，×200）
Akt 60 kDa
2.2.7 小鼠脾脏组织中氧化相关因子活性/含量检测 取
各组小鼠的脾脏组织，用生理盐水制成 10% 的匀浆，检 p-Akt 60 kDa
测匀浆中 SOD、MDA、GSH-Px 的活性和 8-OHdG 的含 PI3K 110 kDa
量。具体方法参照各试剂盒说明书，结果如表 3 所示。
TNF-α 25 kDa
与 CON 组比较，MOD 组的 SOD 和 GSH-Px 活性均显著
降低（P＜0.01），而 MDA 活性和 8-OHdG 含量均显著升 β-actin 43 kDa
高（P＜0.01）；与 MOD 组比较，POS 组、GD 组、GG 组小
CON组 MOD组 GG组 GD组
鼠脾脏组织中SOD和GSH-Px活性均显著升高（P＜0.05 图3 归脾丸对小鼠脾脏组织中 TNF-α、PI3K 和 p-Akt
或P＜0.01），MDA活性和8-OHdG含量均显著降低（P＜ 蛋白表达影响的电泳图
0.05或P＜0.01）。
表4 归脾丸对小鼠脾脏组织中TNF-α、PI3K、p-Akt蛋
表3 归脾丸对小鼠脾脏组织中氧化相关因子活性/含
白表达水平的影响（x±s，n＝18）
量的影响（x±s，n＝18）
组别 TNF-α PI3K p-Akt/Akt
组别 SOD/（U/mL） GSH-Px/（U/mL） MDA/（U/mL） 8-OHdG/（ng/mL） CON组 0.38±0.05 0.37±0.06 0.33±0.06
CON组 11.83±0.19 1 146.90±98.61 2.55±0.04 0.30±0.07 MOD组 0.99±0.05 a 1.06±0.11 a 1.09±0.06 a
MOD组 8.94±0.35 a 661.40±124.60 a 5.98±0.14 a 0.50±0.01 a GD组 0.83±0.03 b 0.91±0.05 b 0.83±0.06 b
POS组 11.32±0.03 b 1 028.65±47.64 b 3.35±0.50 b 0.35±0.06 b GG组 0.61±0.06 c 0.75±0.10 c 0.68±0.06 c
GD组 10.02±0.06 c 785.38±18.01 c 4.80±0.05 c 0.46±0.03 c
a：与CON组比较，P＜0.01；b：与MOD组比较，P＜0.05；c：与MOD
GG组 10.69±0.03 b 878.36±9.00 b 4.14±0.06 b 0.41±0.01 b
组比较，P＜0.01
a：与CON组比较，P＜0.01；b：与MOD组比较，P＜0.01；c：与MOD 3 讨论
组比较，P＜0.05
本研究通过网络药理学方法筛选归脾丸调节衰老
2.2.8 小鼠脾脏组织中相关蛋白表达情况检测 采用
小鼠免疫功能的作用靶点，结果发现Akt1、TNF、IL-6等
Western blot 法进行测定。分别称取各组（POS 组除外）
小鼠脾脏组织，各加入 1 mL RIPA 蛋白裂解液和 10 μL 为核心靶点；分析 KEGG 通路富集结果得出，TNF 信号
磷酸酶抑制剂，制成10%的匀浆。冰上静置裂解30 min 通路和PI3K-Akt信号通路上富集的靶点较多，是与免疫
后，放入高速离心机以12 000 r/min离心20 min，取上清 相关的通路。之后，采用 Western blot 法检测小鼠脾脏
液，以 BCA 法测定各组脾脏组织上清液中蛋白含量。 组织中 TNF/PI3K-Akt 途径中关键蛋白的表达，结果表
加入含有β-巯基乙醇的上样缓冲液，将样品放入沸水中 明，衰老模型小鼠脾脏组织中 TNF-α、PI3K、p-Akt 蛋白
煮沸20 min变性，调整浓度至每组蛋白上样量为30 μg， 表达水平均显著升高，而归脾丸可降低免疫衰老模型小
使用微量上样器于每孔加入 15 μL 蛋白待测样品，以 鼠脾脏组织中 TNF-α、PI3K、p-Akt 蛋白的表达水平，表
10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白进行浓缩和分离。在 明归脾丸可能通过调控 TNF/PI3K-Akt 途径发挥免疫调
冰浴中将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，于封闭液（含 节的作用。

中国药房 2023年第34卷第12期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 12 · 1429 ·