Page 25 - 《中国药房》2023年12期
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正常的机体免疫系统可以有效地防止病原体入侵，                         phoinositide-3-kinase，PI3K）、蛋白激酶 B（threonine pro‐
          能够维持生命体的正常运转和生理平衡，而衰老则会导                           tein kinase，Akt）、磷酸化的Akt（p-Akt）单克隆抗体（批号
                                            [1]
          致机体结构和功能逐步发生退行性变化 。美国病理学                           均为20230315）均购自美国ABclonal公司。
          家 Walford 提出的免疫衰老学说认为，机体衰老是由于                      1.3 实验动物
          机体的免疫功能衰退所致，免疫系统从根本上决定了机                               清洁级健康雄性ICR小鼠105只，体质量（20±2）g，
                  [2]
          体的衰老 ；衰老还会导致促炎因子的亚临床积聚，表现                          由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，实验动
          为不断增加的慢性炎症，而这种炎症会导致免疫系统功                           物生产许可证号为SCXK（吉）-2020-0002。将小鼠于标
          能障碍   [3―4] 。服用传统中药可以提升自身的免疫力，使                    准实验室分笼饲养，自由饮食。实验经北华大学机构动
          上述情况有所改善。                                          物护理与使用委员会批准，审批号为20200915P005。
              归脾丸最早出自宋代严用所著《济生方》中的“归脾                        2 方法与结果
          汤”，是中医补益方剂，从 1985 年开始被《中国药典》收
                                                             2.1 网络药理学研究
          载。归脾丸处方中共有11味药，分别是党参、炒白术、炙
                                                             2.1.1 归脾丸靶点预测 以归脾丸方中各药材名为关
          黄芪、炙甘草、当归、茯苓、制远志、炒酸枣仁、龙眼肉、木
                                                             键词，运用 TCMSP 数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.
          香、大枣（去核）。全方有益气补血、养心健脾之功效，主
                                                             php）查找其有效成分及作用靶点。通过UniProt数据库
          要用于治疗心脾两虚和脾不统血诸证，在临床中对甲状
                                                            （https：//www.uniprot.org/）将筛选所得靶点转化为基因
          腺功能亢进、高血脂也有较好的疗效。现代临床常用于                           名，种属为 Homo sapiens（Human）。在口服生物利用
                                [6]
                          [5]
                                              [7]
          治疗白细胞减少症 、早搏 、胃食管反流病 等。网络药
                                                                                                    [9]
                                                             度≥30%、药物相似性≥0.18 的筛选条件下 ，共获得
          理学可研究药物、靶点之间的相互作用网络，以及其在
                                                             142 个成分，去重后得到 125 个药物成分。经 UniProt 数
                                    [8]
          疾病发生和进展中的作用机制 。因此，本研究运用网
                                                             据库转换后得267个药物成分靶点。
          络药理学方法预测归脾丸调节免疫的作用靶点，并通过
                                                             2.1.2 免疫相关靶点预测 在 OMIM 数据库（https：//
          药效学实验对预测结果进行验证，以期为揭示归脾丸的
                                                             www.omim.org/）和 GeneCard 数据库（https：//www.ge-
          免疫调节机制提供参考。
                                                             necards.org/）中搜索关键词“immunity”，获得免疫相关靶
          1 材料
                                                             蛋白基因。其中，通过OMIM数据库查得疾病相关靶点
          1.1 主要仪器
                                                             901 个，筛选有“*”标注的靶点后得 166 个疾病相关靶
              本研究所用主要仪器有F50型全自动酶标仪（瑞士
                                                             点，又经GeneCard数据库筛选后得1 088个相关靶点，合
          Tecan 公司），JA 型精密电子天平（沈阳科瑞永兴化玻仪
                                                             并去重后得疾病靶点1 119个。将归脾丸的作用靶点和
          器有限公司），LD5-10B型高速离心机（北京京立离心机
                                                             免疫相关靶点分别输入 Draw Venn Diagram 在线工具
          有限公司），HS-B7126-A 型石蜡包埋机和 HS-S7120-A
                                                            （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得87
          型石蜡切片机（沈阳恒松科技有限公司），IX73型倒置显
                                                             个归脾丸调节免疫的潜在作用靶点。
          微镜（日本Olympus公司）等。
                                                             2.1.3 蛋白相互作用网络的构建 将上述潜在作用靶
          1.2 主要药品与试剂
                                                             点输入到 STRING 数据库（https：//cn.string-db.org/）中，
              归脾丸（国药准字Z51020459）购自太极集团四川绵
                                                             以“Homo sapiens”作为限定属性，绘制交集靶点的相互
          阳制药有限公司；D-半乳糖（D-gal，批号20200902）购自
                                                             作用网络，将结果导入 Cytoscape 3.7.1 软件，分别利用
          美国Sigma公司；匹多莫德口服溶液（阳性对照药，国药
          准字 H20030463）购自江苏吴中医药集团有限公司苏州                      cytoNCA 和 cytoHub 插件进行度值分析，对度值结果进
          制药厂；白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因              行排序，筛选出归脾丸调节免疫的重要靶点。结果显
          子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-2、IL-4 酶联免   示，TNF、IL-6、Akt1 的节点面积大、颜色深，表明这 3 个
          疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号均为 12/2021）均购自                   靶点之间的联系紧密，故下一步将通过药效学实验进一
          上海酶联生物科技有限公司；免疫球蛋白 G（immuno‐                       步验证这3个靶点在归脾丸调节免疫中的作用机制。
          globulin G，IgG）、IgM、IgA ELISA 试剂盒（批号分别为            2.1.4 KEGG 富集分析 采用 DAVID 数据库（https：//
          G20220318LF、G20220318UF、G20220318LI）均购自上           david.ncifcrf.gov/）对 87 个潜在作用靶点进行 KEGG 通
          海朗顿生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide                     路富集分析，共得到 157 条归脾丸调节免疫相关的信号
          dismutase，SOD）、谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶（glutathione       通路，显著性差异排名前 15 位的信号通路如图 1 所示。
          peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、       其中，TNF信号通路和PI3K-Akt信号通路是免疫炎症相
          8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）        关通路，这两条通路均与炎症、免疫、细胞增殖凋亡等进
          试剂盒（批号均为 20211224）均购自南京建成生物工程                      程密切相关      [10―11] ，因此下文在药效学实验中选择 TNF/
          研 究 所 有 限 公 司 ；TNF- α、磷 酸 肌 醇 -3- 激 酶（phos‐        PI3K-Akt途径进行验证。


          中国药房  2023年第34卷第12期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 12    · 1427 ·
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