Page 49 - 中国药房2023年10期
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2.4 心肌梗死体积比测量 3 结果
将大鼠麻醉处死后，摘取心脏，用磷酸盐缓冲液 3.1 血清中cTnI、CK-MB含量比较
（PBS）清洗后，冻存在－80 ℃的冰箱中。5 min后，每组 与假手术组比较，模型组大鼠血清中 cTnI、CK-MB
随机选取 5 只大鼠的心肌组织，切片，放入 1%TTC 溶液 含量均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组
中，于 37 °C 下避光孵育 30 min，再将组织用 4% 多聚甲 和 AST 低、高剂量组大鼠血清中 cTnI、CK-MB 含量均
醛溶液浸泡 24 h。用数码相机收集图像并通过 Image- 显著降低（P＜0.05）；与 AST 高剂量组比较，AST 高剂
Pro Plus软件测量大鼠心肌梗死面积，计算心肌梗死体积 量+HIF-1α抑制剂组大鼠血清中cTnI、CK-MB含量均显
比＝（心肌梗死面积×厚度）/（心肌面积×厚度）×100%。 著升高（P＜0.05）。结果见表1。
2.5 心肌组织病理形态观察 表1 各组大鼠血清中 cTnI、CK-MB 含量和心肌梗死
每组随机选取5只剩余大鼠冻存的心肌组织，用4% 体积比、细胞凋亡率比较（x±s，n＝25或n＝5）
多聚甲醛溶液固定过夜，石蜡包埋、切片、脱蜡，水化后 组别 cTnI/（pg/mL） CK-MB/（U/mL） 心肌梗死体积比/% 细胞凋亡率/%
用苏木素-伊红染色、PBS 清洗切片、脱水、透明、封片。 假手术组 42.35±2.36 82.16±2.56 0 2.67±0.42
用光学显微镜观察大鼠的心肌组织病理形态。 模型组 118.73±4.12 a 163.86±4.28 a 27.63±2.75 a 35.47±2.63 a
阳性对照组 50.62±2.28 b 90.38±2.87 b 12.96±1.37 b 11.64±1.26 b
2.6 心肌细胞凋亡率测定 AST低剂量组 83.32±3.27 b 131.27±3.43 b 20.18±2.34 b 25.19±2.21 b
取“2.5”项下石蜡切片进行脱蜡，PBS 清洗 3 次，加 AST高剂量组 56.17±2.43 b 98.46±3.11 b 14.37±1.42 b 17.43±1.82 b
入蛋白酶K孵育30 min；加入配制好的TUNEL工作液， AST高剂量+HIF-1α抑制剂组 107.66±3.86 c 157.61±3.80 c 25.59±2.51 c 31.58±2.50 c
a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与AST
于 37 ℃下避光放置 1 h；用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚
高剂量组比较，P＜0.05
（DAPI）染液复染 10 min，PBS 脱色 3 次，晾干后封片。
3.2 心肌梗死体积比和细胞凋亡率比较
用荧光显微镜观察拍照，并计算大鼠心肌细胞凋亡率。
与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死体积比和细
2.7 心肌组织中 TNF-α、IL-6、MDA 含量和 SOD 活性
胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对
测定
照组和AST低、高剂量组大鼠心肌梗死体积比和细胞凋
每组随机选取 5 只剩余大鼠冻存的心肌组织，加入
亡率均显著降低（P＜0.05）；与AST高剂量组比较，AST
PBS 研磨，于 4 ℃下 5 000×g 离心 10 min，收集上清液。
高剂量+HIF-1α抑制剂组大鼠心肌梗死体积比和细胞凋
根据试剂盒说明书操作，测定大鼠心肌组织中 TNF-α、
亡率均显著升高（P＜0.05）。结果见表1、图1和图2。
IL-6、MDA含量和SOD活性。
2.8 心肌组织线粒体的超微结构观察
每组随机选取 5 只剩余大鼠冻存的心肌组织，用
1.5%戊二醛和1%四氧化锇双重固定，丙酮脱水后用环
氧丙烷包埋，切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅双染色。用
透射电子显微镜观察大鼠心肌组织线粒体的超微结构。
2.9 心肌组织中 HIF-1α、BNIP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1 蛋
白表达测定
取每组剩余的 5 只大鼠的冻存心肌组织，加入蛋白
裂解液，置于冰上匀浆，离心收集上清液，BCA法测定蛋
白浓度后，用电泳分离蛋白并转至聚偏二氟乙烯膜，封
闭过夜，用一抗（HIF-1α、BNIP3 抗体稀释比例 1∶1 000，
LC3抗体稀释比例1∶500，Beclin1抗体稀释比例1∶2 000） A B C D E F
室温孵育 2 h，再用羊抗兔 IgG 二抗（稀释比例 1∶1 000） A：假手术组；B：模型组；C：阳性对照组；D： AST低剂量组；E：
室温振荡孵育2 h，洗膜后显影，在凝胶成像仪中观察蛋 AST高剂量组；F：AST高剂量+HIF-1α抑制剂组
白条带。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，用Gel-Pro ana‐ 图1 各组大鼠心肌梗死的TTC染色图
lyzer4 软件分析目标蛋白表达量，并计算 LC3Ⅱ与 LC3 3.3 心肌组织病理形态比较
Ⅰ的比值（以下简称“LC3Ⅱ/Ⅰ”）。 如图3所示，假手术组大鼠心肌组织结构正常，细胞
2.10 统计学分析 整齐；与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中细胞减
本研究数据均采用 Graphpad prism8.0 软件进行统 少、肿胀明显，且心肌纤维排列紊乱；与模型组比较，阳
计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素 性对照组和 AST 低、高剂量组大鼠心肌组织中细胞变
方差分析，组间两两比较采用 SNK-q 检验。检验水准 多、无明显肿胀，心肌纤维排列整齐；AST 高剂量+HIF-
α＝0.05。 1α抑制剂组大鼠心肌组织的形态与模型组相似。
中国药房 2023年第34卷第10期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 10 · 1195 ·
