Page 33 - 中国药房2023年10期

2.4 小鼠脊髓组织形态学观察 2.7 统计学方法
取“2.3”项下固定的脊髓组织，采用HE染色法观察 使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行数据分析并作
炎症细胞浸润情况，并按如下标准进行评分：未见炎症 图。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
细胞，记0分；发现少量散在炎症细胞，记1分；发现大量 析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
炎症细胞聚集呈袖套样，记2分；大量血管袖带病变，记 3 结果
[6]
3分 。采用LFB染色法观察髓鞘脱失情况，并按如下标 3.1 苦参素对小鼠神经功能学评分的影响
准进行评分：无髓鞘脱失，记 0 分；罕见脱髓鞘，记 1 分； 与正常组比较，模型组小鼠实验期间的单日神经功
能学评分呈上升趋势，其累计神经功能学评分显著升高
[9]
少量脱髓鞘，记2分；大范围脱髓鞘，记3分 。每只小鼠
（P＜0.01）；与模型组比较，苦参素组小鼠的单日神经功
取3个组织切片进行评分，取平均值。
能学评分均有所降低，其累计神经功能学评分显著降低
2.5 小鼠脊髓组织中铁死亡生物标志物mRNA表达水
（P＜0.01）。结果见图1。
平检测
5.0 a
采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法进行 4.0 正常组 20
模型组
3.5
检测。取“2.3”项下冻存的脊髓组织适量，加入Trizol试 神经功能学评分/分 4.5 苦参素组 累计神经功能学评分/分 25 b
3.0
15
剂 1 mL，充分研匀后提取总 RNA 并测定其浓度。取总 2.5 10
2.0
1.5
RNA 1 μg，逆转录合成 cDNA，然后以此 cDNA 为模板 1.0 5
0.5
0 0
进行 PCR 扩增。反应体系（20 μL）包括：cDNA 模板 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 正常组 模型组 苦参素组
免疫天数/d
μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，SYBR Green试剂 A.神经功能学评分 B.累计神经功能学评分
10 μL，超纯水 7 μL。反应条件如下：95 ℃预变性 2 a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01
min；95 ℃变性 6 s，60 ℃退火/延伸 34 s，共循环 45 次。 图1 各组小鼠神经功能学评分比较（x±s，n＝10）
以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，以正常组为 3.2 苦参素对小鼠脊髓组织形态学的影响
标准，采用 2 －ΔΔCt 法计算 TFR1、NCOA4、Heph mRNA 的 正常组小鼠的脊髓组织无炎症细胞浸润，髓鞘完
相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公 整；模型组小鼠的脊髓组织可见大量炎症细胞浸润和髓
司设计并合成，引物序列及扩增产物长度见表1。 鞘脱失现象，炎症细胞浸润和髓鞘脱失评分均较正常组
表1 引物序列及扩增产物长度 显著升高（P＜0.01）；苦参素组小鼠脊髓组织的上述症
状均明显改善，炎症细胞浸润和髓鞘脱失评分均较模型
目标基因 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp
GAPDH 上游：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 100 组显著降低（P＜0.01）。结果见表2、图2。
下游：TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 表2 各组小鼠脊髓组织形态学相关评分比较（x±s，
TFR1 上游：TAGGCCGCGGGTTCGAG 118
下游：TGCTACAAGGGAGTACCCCGA n＝10）
NCOA4 上游：AACACTGCCGACTGGGTTTT 105 组别 平均炎症细胞浸润评分/分 平均髄鞘脱失评分/分
下游：AGCTGCATACAGGCAAAGAGA 正常组 0 0
Heph 上游：GCTGAGGGTCCTAAGGAATGGATA 103 模型组 3.31±0.46 a 3.44±0.50 a
下游：GCCCACAGTACTTTGAGAAACAGG 苦参素组 1.25±0.38 b 1.28±0.37 b
2.6 小鼠脊髓组织中xCT、GPx4蛋白表达水平检测 a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01
采用Western blot法进行检测。取“2.3”项下冻存的 3.3 苦参素对小鼠脊髓组织中铁死亡标志物mRNA表
达的影响
脊髓组织适量，加入 RIPA 裂解液 250 μL，研磨，于 4 ℃
与正常组比较，模型组小鼠脊髓组织中 TFR1、
下以 13 000 r/min 离心 5 min，重复 3 次，取上清液，采用
NCOA4 mRNA 的相对表达量均显著升高，Heph mRNA
BCA 法测定蛋白浓度。蛋白经适量蛋白上样缓冲液稀
的相对表达量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组
释后，于金属浴中煮沸10 min变性；取变性蛋白适量，进
比较，苦参素组小鼠脊髓组织中 TFR1、NCOA4 mRNA
行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以 5%
的相对表达量均显著降低，Heph mRNA 的相对表达量
脱脂奶粉封闭 1.5 h，加入 xCT、GPx4、β-actin 一抗（稀释
显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表3。
度分别为1∶5 000、1∶5 000、1∶10 000），于4 ℃孵育过夜； 3.4 苦参素对小鼠脊髓组织中 xCT、GPx4 蛋白表达的
用 TBST 洗涤 7 min×3 次，加入相应二抗（稀释度均为 影响
1∶5 000），室温孵育1 h；用ECL发光液显影曝光，再使用 与正常组比较，模型组小鼠脊髓组织中 xCT、GPx4
凝胶成像系统成像。采用Image J软件分析蛋白条带灰 蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，
度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比 苦参素组小鼠脊髓组织中上述蛋白的表达水平均显著
值表示目的蛋白的表达水平。 升高（P＜0.05）。结果见图3、表4。

中国药房 2023年第34卷第10期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 10 · 1179 ·