Page 38 - 中国药房2023年10期

“2.2.1”项下方法分组、给药后，收集细胞，用磷酸盐缓 min，取上层血清，按试剂盒说明书操作，测定各组大鼠
冲液（PBS）清洗3次，加入PBS 1 mL，收集细胞悬液，以 血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量和AST、ALT活性。
2 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液，加入 2%Triton X- 2.3.6 肝组织中抗氧化相关指标的测定 取各组大鼠
100反复冻融3次，按试剂盒说明书操作，测定LO2细胞 肝组织，用生理盐水清洗后，按肝组织（g）与生理盐水
内TG、TC、MDA、GSH含量和AST、ALT、SOD活性。 （mL）1∶9的比例制备肝匀浆，于4 ℃下以3 500 r/min离
2.2.3 细胞内脂滴沉积的观察 按“2.2.1”项下方法分 心15 min，取上清液，按试剂盒说明书操作，测定各组大
组、给药后，弃去药液，用PBS清洗，加入4%多聚甲醛溶 鼠肝组织中MDA、GSH含量和SOD活性。
液固定，再用 PBS 清洗后加入 60% 异丙醇漂洗，用配制 2.4 统计学方法
好的油红O染液避光染色，弃去染色液后加入60%异丙 利用SPSS 21.0软件进行统计分析。数据用x±s表
醇分化，随后加入蒸馏水终止染色，在显微镜下观察脂 示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方
滴沉积并拍照。 差齐时采用 LSD-t 检验，方差不齐时采用非参数检验。
2.2.4 细胞内Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA表达的测定 按 检验水准α＝0.05。
“2.2.1”项下方法分组、给药后，提取细胞内RNA，经过逆 3 结果
转录后，运用实时定量 PCR 法检测细胞内 Kelch 样环氧 3.1 体外实验
氯丙烷相关蛋白 1（Kelch-like ECH-associated protein， 3.1.1 小白薇不同萃取物对细胞内脂质、肝功能和抗氧
Keap1）、核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related 化水平的影响 与正常组比较，模型组细胞内 TC、TG、
factor 2，Nrf2）、血红素氧合酶 1（heme oxygenase 1，HO- MDA 含量和 ALT、AST 活性均显著升高（P＜0.05），
1）mRNA 表达水平。扩增条件（反应体系 20 μL）为： GSH含量和SOD活性均显著降低（P＜0.05）。与模型组
95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共 比较，各给药组细胞内 TC（TYS 组、TYSA 组、TYSB 组
40个循环。以GAPDH为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算目标基 除外）、TG、MDA含量（TYSB组除外）和AST、ALT活性
因的 mRNA 的表达水平。各引物由江苏愚公生物科技 均显著降低（P＜0.05），GSH 含量（水飞蓟宾组除外）和
有限公司设计合成，其引物序列与产物长度见表1。 SOD 活性（TYS 组、TYSB 组除外）均显著升高（P＜
表1 引物序列与产物长度 0.05），其中 TYSA 组的 TG、MDA、ALT 变化较 TYS 组、
目标基因 引物序列 产物长度/bp TYSB组更明显（P＜0.05）。结果见表2。
Keap1 上游：5′-GTGTCCATTGAGGGTATCCACC-3′ 41 表2 各组细胞内脂质、肝功能和抗氧化相关指标比较
下游：5′-GCTCAGCGAAGTTGGCGAT-3′
Nrf2 上游：5′-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA-3′ 43 （x±s，n＝3）
下游：5′-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3′ TC/ TG/ MDA/ GSH/ ALT/ AST/ SOD/
HO-1 上游：5′-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3′ 42 组别 （mmol/L） （mmol/L）（nmol/mg prot）（μmol/g prot） （U/L） （U/L） （U/mg prot）
下游：5′-AAAGCCCTACAGCAACTGTCG-3′ 正常组 0.03±0.01 0.04±0.01 0.11±0.01 49.17±3.61 0.22±0.05 0.15±0.07 532.77±20.14
a
a
a
a
2.3 体内实验 模型组 0.10±0.02 0.38±0.01 a 0.22±0.02 a 40.20±1.24 2.25±0.17 2.26±0.24 408.31±11.87 a
b
b
水飞蓟宾组 0.05±0.01 0.17±0.01 b 0.19±0.02 b 41.69±1.44 0.26±0.13 0.66±0.24 476.25±48.19 b
b
2.3.1 建模、分组与给药 在前期实验基础上设计分组
b
TYS组 0.09±0.02 0.20±0.03 b 0.20±0.01 b 47.37±1.48 0.89±0.08 0.92±0.26 460.73±39.91
b
b
与给药剂量。将36只大鼠适应性饲养1周后，随机分为 TYSA组 0.08±0.01 0.17±0.04 bcd 0.18±0.01 bcd 47.84±0.41 0.64±0.14 0.83±0.19 472.39±11.06 b
b
b
bcd
b
b
b
正常组、模型组、水飞蓟宾组（12.6 mg/kg）、TYS 组（80 TYSB组 0.09±0.02 0.27±0.03 b 0.21±0.01 45.94±3.16 0.88±0.20 1.05±0.31 452.12±29.52
mg/kg）、TYSA组（80 mg/kg）、TYSB组（80 mg/kg），每组 a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与TYSB
6 只。正常组大鼠给予基础饲料；其余各组大鼠给予高 组比较，P＜0.05；d：与TYS组比较，P＜0.05
脂饲料，饲养 12 周建立 NASH 大鼠模型。建模成功后， 3.1.2 小白薇不同萃取物对细胞内脂滴沉积的影响 如
正常组和模型组每天给予同体积的生理盐水，各给药组 图1所示，正常组细胞内未见红色脂滴；模型组细胞内有
大鼠分别给予相应药液，每天1次，连续灌胃6周。 大量红色脂滴，部分区域出现脂滴融合；与模型组比较，
2.3.2 大鼠体质量的测定 给药期间每周测定各组大 各给药组细胞内脂滴均有不同程度的减少，说明水飞蓟
鼠的体质量。 宾和 TYS、TYSA、TYSB 均能减轻 LO2 细胞脂肪变性后
2.3.3 大鼠肝脏指数的计算 各组大鼠末次给药后禁 的脂滴沉积。
食12 h，然后用10%戊巴比妥钠麻醉，取血后处死，迅速取 3.1.3 小白薇不同萃取物对细胞内 Keap1、Nrf2、HO-1
出肝脏，用生理盐水清洗并吸干多余水分，记录肝脏湿质量 mRNA表达水平的影响 与正常组比较，模型组细胞内
并计算肝脏指数：肝脏指数＝肝脏湿质量/体质量×100%。 Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA 表达水平均显著降低（P＜
2.3.4 肝脏病理形态学观察 取各组大鼠肝组织，用 0.05）。与模型组比较，各给药组细胞内Keap1、Nrf2（水
4% 多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片（厚 5～7 飞蓟宾组、TYS 组、TYSB 组除外）、HO-1（水飞蓟宾组、
μm）后，用HE染色，在显微镜下观察并拍照。 TYS组、TYSB组除外）mRNA表达水平均显著升高（P＜
2.3.5 血 清 中 血 脂 和 肝 功 能 相 关 指 标 的 测 定 取 0.05），其中 TYSA 组的 Nrf2 和 HO-1 mRNA 表达水平变
“2.3.3”项下大鼠全血，于 4 ℃下以 3 500 r/min 离心 10 化较TYS组、TYSB组更明显（P＜0.05）。结果见表3。
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