Page 32 - 中国药房2023年10期
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乱和胱氨酸-谷氨酸反向转运体（system Xc ，xCT）/谷胱                   PCR 试剂盒（批号 11202ES08）购自翌圣生物科技（上
                                              －
          甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPx4）通路          海）股 份 有 限 公 司 ；超 敏 ECL 发 光 试 剂 盒（批 号
          失调是引起铁死亡的关键因素 。正常生理状态下，摄                            WBKLS0100）购自美国Millipore公司；BCA蛋白定量试
                                     [2]
          取 铁 离 子 的 转 铁 蛋 白 受 体 1（transferrin  receptor  1，   剂盒（批号 PA101-01）购自北京博迈德基因技术有限公
          TFR1）、介导铁自噬的核受体共激活因子 4（nuclear re‐                  司；兔源 xCT 抗体（批号 ab175186）购自英国 Abcam 公
          ceptor coactivator 4，NCOA4）和促进铁离子外排的膜铁              司；鼠源 GPx4 单克隆抗体、鼠源 β-肌动蛋白（β-actin）单
          转运辅助蛋白（hephaestin，Heph）共同维持了少突胶质                    克隆抗体（批号分别为67763-1-Ig、66009-1-Ig）均购自武
          细胞的铁稳态；而当 MS 发生时，铁稳态失衡导致铁蓄                          汉三鹰生物技术有限公司；生物素标记的羊抗兔免疫球
          积，使得脂质活性氧大量产生，从而造成细胞铁死亡，最                           蛋白 G（IgG）二抗、生物素标记的羊抗小鼠 IgG 二抗（批
                          [3]
          终诱导轴突脱髓鞘 。有研究指出，xCT和GPx4协同作                         号分别为 GB23303、GB23301）均购自武汉塞维尔生物
          用，将细胞外的胱氨酸转运至细胞内以合成抗氧剂谷胱                            科技有限公司。
          甘肽（glutathione，GSH），后者可清除脂质过氧化物，抑                   1.3 实验动物
                  [4]
          制铁死亡 。最近有研究发现，在MS患者大脑和实验性
                                                                  SPF 级 雌 性 C57BL/6 小 鼠 ，8～10 周 龄 ，体 质 量
          自 身 免 疫 性 脑 脊 髓 炎（experimental  autoimmune  en‐
                                                             （20±2）g，购自郑州大学实验动物中心，动物生产许可
          cephalomyelitis，EAE）模型（该模型与MS的病理特征非                 证号为 SCXK（豫）2020-0008。所有小鼠均饲养于郑州
          常相似，是经典的动物模型）小鼠脊髓神经元中，GPx4                          大学实验动物中心 SPF 级动物房内。动物实验程序经
                                        [5]
          mRNA和蛋白的表达量均有所下降 。
                                                              郑州大学实验动物管理和使用委员会审查批准，批准号
              苦参素是从豆科植物苦参和苦豆子中提取出来的
                                                              为2019-KY-142。
          一种喹嗪啶类生物碱，具有抗氧化、抗炎、免疫调节等作                           2 方法
          用。考虑到铁依赖性的脂质过氧化反应可能是导致少
                                                              2.1 小鼠分组、造模与给药
                                  [2]
          突胶质细胞髓鞘脱失的原因 ，本课题组前期研究发现，
                                                                  将 30 只雌性 C57BL/6 小鼠随机分为正常组、模型
          苦参素对少突胶质细胞具有保护作用，能促进其髓鞘再
                                                              组、苦参素组，每组10只。将灭活结核分枝杆菌100 mg
          生，并可降低EAE小鼠CNS中的谷氨酸浓度，解除高浓
                                                              置于完全弗氏佐剂10 mL中，待完全溶解后用等体积的
          度谷氨酸对 xCT 的抑制作用          [5―7] 。基于此，本研究拟进
                                                              2 mg/mL MOG35-55 溶液吹打，制成油包水抗原乳剂。
          一步探讨苦参素能否通过维持铁稳态和调控xCT/GPx4
                                                              除正常组外，其余各组小鼠均于3个不同部位皮下注射
          通路来发挥对EAE小鼠的改善作用，旨在为MS的临床
                                                              上述油包水抗原乳剂200 μL进行免疫，并在免疫当天和
          治疗提供参考。
          1 材料                                                第 2 天腹腔注射百日咳毒素 200 ng，以复制 EAE 模型
                                                             （若实验期间小鼠神经功能学评分≥1 分即为模型复制
          1.1 主要仪器
                                                                  [6]
                                                              成功 ）。苦参素组小鼠从免疫后第 7 天开始腹腔注射
              本研究所用主要仪器有 CMaxPlus 型酶标仪（美国
                                                                                  [7]
                                                              苦参素注射液50 mg/kg ，每天1次至免疫后第18天；正
          Molecular Devices 公司），ND-ONE-型超微量分光光度
                         TM
          计、QuantStudio 5 型荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪                   常组和模型组小鼠腹腔注射等体积生理盐水，每天1次
                                                              至免疫后第18天。
         （美国 Thermo Fisher Scientific 公司），Amersham Imager
          600 型超灵敏多功能成像系统（美国 GE 公司），BX53 型                    2.2 小鼠神经功能学评分
          荧光显微镜（日本 Olympus 公司），Eclipse C1 型正置显                    实验期间（免疫当天至免疫后第18天），每天由2名
          微镜（日本Nikon公司）等。                                     实验人员按照双盲原则以5分评分法对小鼠进行神经功
          1.2 主要药品与试剂                                         能学评分，具体标准如下：尾部无力，记1分；后肢无力，
              苦参素注射液（批号 1902012A1，规格 2 mL∶0.2 g）              记 2 分；后肢瘫痪，记 3 分；四肢瘫痪，记 4 分；濒死或死
                                                                      [8]
          购自郑州卓峰制药有限公司；完全弗氏佐剂（批号                              亡，记5分 。记录各组小鼠的累计神经功能学评分（即
          F5881）购自美国Sigma公司；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白                       各组小鼠单日神经功能学评分的总和）。
          片段 MOG35-55（纯度 98.19%）由南京金斯瑞生物科技                    2.3 取材
          有限公司合成；灭活结核分枝杆菌（批号231141）购自美                            末次给药后，对各组小鼠实施安乐死并灌注生理盐
          国 BD 公司；百日咳毒素（批号 LIST181）购自美国 LTST                  水，迅速分离脊髓。取腰椎膨大处脊髓组织，用4%多聚
          Labs 公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、勒克斯光蓝                       甲醛溶液固定 48 h，常规石蜡包埋后切片（厚度 5 μm），
         （Luxol fast blue，LFB）髓鞘染色液（批号分别为 G1120、              用于组织学评估；剩余脊髓组织剥除脊膜，放入冻存管
          G3240）均购自北京索莱宝科技有限公司；逆转录试剂盒                         中经液氮速冻后置于－80 ℃冰箱中保存，用于相关指标
         （批号 RR047A）购自日本 Takara 公司；SYBR 荧光定量                  检测。


          · 1178 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 10                            中国药房  2023年第34卷第10期
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