Page 81 - 《中国药房》2023年9期
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          为觉醒 。记录睡眠潜伏期和睡眠时长，其中腹腔注射                           2.3 统计学方法
          结束至翻正反射消失时间为睡眠潜伏期（s），翻正反射                              采用SPSS 26.0软件进行统计分析，实验结果以x±s
          消失至恢复时间为睡眠时长（min）。                                 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较
          2.1.4 小鼠生物样本收集、处理及下丘脑病理形态学观                        采用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。
          察 末次给药的前 1 d，各组小鼠禁食不禁水。末次给                         3 结果
          药结束后，各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻                      3.1 复方枣仁颗粒改善失眠的药效学研究结果
          醉，眼球取血，室温静置1 h，然后在4 ℃下以3 500 r/min                 3.1.1 小鼠旷场实验结果 与空白组比较，模型组小鼠
          离心 15 min，收集血清，置于－80 ℃冰箱中冻存。于冰                     总行进距离、中央区域进入次数、中央区域移动距离显
          上快速分离小鼠大脑及下丘脑组织，经 4% 多聚甲醛固                         著减少（P＜0.05），总静息时间比例显著升高（P＜0.05）。
          定、包埋、切片（4 μm）、苏木精-伊红（HE）染色后，在光                     与模型组比较，复方枣仁颗粒低、中剂量组小鼠总行进
          学显微镜下观察小鼠下丘脑病理损伤并采集图像。                             距离显著增加（P＜0.05），阳性对照组1和复方枣仁颗粒
          2.2 复方枣仁颗粒的血清代谢组学研究
                                                             低、中剂量组小鼠总静息时间比例显著降低（P＜0.05）。
          2.2.1 血清样本处理 取冻存的血清200 µL，加入预冷
                                                             结果见表1。
          的乙腈600 µL，涡旋1 min后在4 ℃下以12 000 r/min离
                                                                表1 各组小鼠的旷场实验测试结果（x±s，n＝7）
          心15 min，取上清液，氮吹至干。加入100 µL乙腈复溶，
          涡旋 1 min 后继续在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，         组别          总行进距离/mm  总静息时间比例/%  中央区域进入  中央区域移
                                                                                              次数/次
                                                                                                      动距离/mm
          取上清液进行分析。从每份上清液样品中各取 20 µL，                         空白组        28 387.28±3 687.27  22.41±7.03  6.00±2.24  1 202.56±390.31
          混合后作为质量控制（quality control，QC）样本，用以评                 模型组        14 747.87±4 629.34 a  44.26±9.94 a  2.71±1.38 a  523.87±321.26 a
                                                              阳性对照组1     20 900.59±10 856.35  29.04±14.68 b  4.86±5.87  851.71±994.32
          估分析过程的稳定性和重现性。
                                                              阳性对照组2     18 596.95±8 945.55  40.05±14.11  2.29±3.20  428.63±572.59
          2.2.2 色谱与质谱条件 色谱条件：采用 ACQUITY                       复方枣仁颗粒低剂量组 24 352.29±6 537.79 b  27.31±11.32 b  4.86±3.29  856.07±646.63
               ®
          UPLC  HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以            复方枣仁颗粒中剂量组 21 955.75±5 482.74 b  32.19±6.77 b  4.57±3.36  882.15±804.89
          0.05%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～                      复方枣仁颗粒高剂量组 19 715.83±5 370.75  35.03±10.14  2.71±1.80  679.04±534.54
                                                                a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
          1 min，2%B；1～3 min，2%B→50%B；3～14 min，50%B→
          60%B；14～18 min，60%B→90%B；18～19 min，90%B→           3.1.2 小鼠戊巴比妥钠协同催眠实验结果 与空白组
          100%B；19～20 min，100%B→2%B；20～22 min，2%B）；          比较，模型组小鼠的睡眠潜伏期有所延长，但差异无统
          柱温为40 ℃；流速为0.3 mL/min；进样体积为2 μL。                   计学意义（P＞0.05）；睡眠时长显著缩短（P＜0.05）。与
              质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），在正、负离子                      模型组比较，各给药组小鼠的睡眠潜伏期均不同程度缩
          模式下进行检测；离子化温度为550.0 ℃；雾化气压力为                       短，但差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组 1、2 和
          55 psi；辅助加热气压力为 55 psi；气帘气压力为 30 psi；              复方枣仁颗粒高剂量组小鼠睡眠时长显著延长（P＜
          一级质谱采集范围为质荷比（m/z）50～1 500；去簇电压                     0.05）。结果见表2。
          为 60 V/－60 V；碰撞能量为 45 eV/－45 eV。采用信息               表2 各组小鼠的戊巴比妥钠协同催眠实验结果（x±s，
          依赖性扫描模式采集二级质谱，采集范围为 m/z 50～                             n＝7）
          1 500；去簇电压为 60 V；碰撞能量为 45 eV。采用美国                   组别                   睡眠潜伏期/s         睡眠时长/min
          AB SCIEX公司的调谐液传递系统对化合物的相对分子                         空白组                  205.57±23.56     98.57±11.79
          量准确度进行自动校准。                                         模型组                  219.29±25.34     67.86±19.13 a
                                                              阳性对照组1               193.57±21.12    167.00±48.93 b
          2.2.3 数据处理与分析 将采集所得的代谢组学质谱                          阳性对照组2               193.00±31.46    143.71±43.48 b
          原始数据通过 Analysis Base File Converter 软件转化为           复方枣仁颗粒低剂量组           198.57±15.73     94.57±34.33
          abf 格式的文件，然后通过 MS-DAIL 3.9 软件及 SEERF                复方枣仁颗粒中剂量组           188.29±45.39     99.14±38.34
                                                              复方枣仁颗粒高剂量组           201.57±10.42    121.29±26.98 b
          平台（https：//slfan2013.github.io/SERRF-online/）进行色
                                                                a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
          谱峰对齐及归一化预处理；再将数据导入SIMCA-P 14.1
          软 件 进 行 主 成 分 分 析（principal  component  analysis，  3.1.3 小鼠下丘脑病理形态学观察结果 与空白组比
          PCA）及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial              较，模型组小鼠下丘脑神经细胞受损且空泡化严重，表
          least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），根据变量  明模型组小鼠下丘脑组织出现损伤。与模型组比较，各
          重要性投影（variable importance in projection，VIP）＞1     给药组小鼠下丘脑组织神经细胞均不同程度恢复，其中
                                 [8]
          且 P＜0.05 筛选差异代谢物 。然后结合人类代谢组数                       阳性对照组2和复方枣仁颗粒高剂量组小鼠下丘脑组织
          据库（HMDB，https：//hmdb.ca），最终确证潜在的生物标                细胞与空白组较为接近。结果见图1。
          志物。将已鉴定的内源性差异代谢物利用 MetaboAna‐                      3.2 复方枣仁颗粒的血清代谢组学研究结果
          lyst 5.0数据库，以impact＞0.1作为筛选条件进行相关代                 3.2.1 PCA结果 PCA结果表明，QC样本在正、负离子
          谢通路分析。                                             模式下均聚集良好，表明该检测方法具有良好的稳定性


          中国药房  2023年第34卷第9期                                                China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 9    · 1095 ·
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