Page 47 - 《中国药房》2023年8期
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相 关 化 学 成 分 信 息 通 过 PubMed、ChemSpider、         温变性后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转
          Swiss Target Prediction、中国知网、中药系统药理数据库             移至硝酸纤维素膜上，用 5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，分
          和分析平台（TCMSP）等数据库查询，具体信息包括成分                        别加入Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、ERα、β-actin一抗（稀释
          名称、CAS号、化学结构、分子式及质谱裂解规律等。                          比例均为 1∶1 000），在 4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗
          2.2 CHCR抗ER阳性乳腺癌作用机制的预测                           （稀释比例为 1∶1 500），室温孵育 2 h；利用 ECL 发光液
              将鉴定所得CHCR的化学成分分别输入TCMSP和                       显色，并置于分子生物成像仪下成像。应用Image J软件
          Swiss Target Prediction 数据库，以口服生物利用度（oral          分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰
          bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-like properties，  度值的比值表示蛋白的表达水平。实验重复3次。
                                            [12]
          DL）≥0.18 为标准筛选药对的活性成分 ，同时纳入已                       2.3.3 CHCR 对 MCF-7 细胞中 ESR1 mRNA 表达的影
          报道的活性成分，在TCMSP和Swiss Target Prediction数            响  采 用 定 量 反 转 录 PCR（quantitative  reverse  trans-
          据库中检索以获得 CHCR 成分靶点。借助 GeneCards、                   criptase-mediated PCR，qRT-PCR）法进行检测。取对数
          OMIM、DrugBank 数据库，以“estrogen receptor-positive     生长期的 MCF-7 细胞，按“2.3.2”项下方法分组、给药。
          breast cancer”为检索词，获取 ER 阳性乳腺癌的疾病靶                 培养48 h后，收集各组细胞，提取细胞总RNA，再反转录
          点。采用 Venny 2.1.0 平台获得“成分-疾病”的交集靶                   为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增（引物序列和
          点。将交集靶点输入至String 11.5数据库以获得靶点间                     产物长度见表1）。反应体系为TB Green Premix Ex Taq
          相互作用关系，同时借助 Cytoscape 3.8.2 软件构建蛋白                （Tli RNaseH Plus）（2X）10 μL、PCR Forward Primer（10
          质-蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络。采       μmol/L）0.4  μL、PCR  Reverse  Primer（10  μmol/L）0.4
          用 DAVID 6.8 数据库进行基因本体（GO）和京都基因与                    μL、ROX  Reference  Dye（50X）0.4  μL、DNA  模 板  2.0
          基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，利用 Omic‐                       μL、灭菌水 6.8 μL，共 20 μL。扩增程序反应条件为：
          Share 平台进行数据可视化展示。最后，采用 Cytoscape                  95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个
          3.8.2 软件构建 CHCR 抗 ER 阳性乳腺癌作用的“活性成                  循环。以GAPDH为内参，采用2           －ΔΔCt 法计算ESR1 mRNA
          分-靶点-通路”关联网络。                                     （ESR1为ERα的基因名）的相对表达量，实验重复3次。
          2.3 CHCR抗ER阳性乳腺癌作用及机制验证                                        表1 引物序列及产物长度
          2.3.1 CHCR 对 MCF-7 细胞的增殖抑制作用 采用
                                                              基因                引物序列                产物长度/bp
          MTT 法进行检测。取对数生长期的 MCF-7 细胞，按                        ESR1     上游引物：5′-TGCCCTACTACCTGGAGAACG-3′  158
               4
          3×10 个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。待细胞贴                              下游引物：5′-TGCACAGTAGCGAGTCTCCTTG-3′  163
                                                              GAPDH    上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′  101
          壁后，分别按终浓度 0（即空白对照组）、0.062 5、0.125、
                                                                       下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′  101
          0.25、0.5、1、2 mg/mL 加入 CHCR 95% 乙醇提取物（制备
                                                             2.4 统计学方法
          方法同“2.1.2”项下）含药培养液（给药剂量依据预实验
                                                                 采用SPSS 27.0软件对数据进行统计分析。数据以
          结果设置）；设置阳性对照孔，分别按终浓度0.125、0.25、
          0.5、1、2、4 μg/mL 加入长春新碱含药培养液（给药剂量                   x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
                                                             比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          依据预实验结果设置）；同时设置不含细胞、不含药物的
          调零孔，每孔加入100 μL不含药培养液。每组设置6个                        3 结果
          复孔。培养 48 h 后，弃去培养液，加入 0.5 mg/mL 的                  3.1 CHCR化学成分的鉴定
          MTT试剂100 μL；孵育4 h后，弃去上清液，每孔加入二                         采用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术所得 CHCR 化学成
          甲基亚砜150 μL，避光振荡后，采用酶标仪于570 nm波                     分的总离子流图如图1所示。通过一级和二级质谱信息
          长下测定各孔的吸光度值，计算细胞增殖抑制率和半数                           分析并结合相关文献，从CHCR中共鉴定出58个化学成
          抑制浓度（IC50 ）。细胞增殖抑制率%＝（空白对照组平                       分，有 23 个来自白屈菜，24 个来自元胡，11 个为二者共
          均 OD 值－给药组平均 OD 值）/空白对照组平均 OD                      有成分；58 个成分中，生物碱类成分有 57 个、有机酸类
          值×100%。实验重复3次。                                     成分有1个，具体信息如表2所示。
          2.3.2 CHCR对富集通路相关蛋白的影响 采用Western                     7.0×10 6              35～38
                                                                                   32～34
          blot法进行检测。取对数生长期的MCF-7细胞，随机分                         6.0×10 6           25～31
                                                               5.0×10 6       17～20
          为空白对照组、阳性对照组（终浓度为 0.5 μg/mL，剂量                       4.0×10 6      14～16  21～22  42～44      55
          设置参考“2.3.1”项下结果）、CHCR 组（终浓度分别为                      响应值/s  3.0×10 6  8～11  23～24             56～58
                                                                            12～13
                                                               2.0×10 6  1～3 4  5～7   39～41  45～46  49～52  53～54
          150、300、600 μg/mL，剂量设置参考“2.3.1”项下结果），                1.0×10 6                    47～48
          每组设置6个复孔。其中，各药物组加入相应含药培养                                0
                                                                   0   2   4   6   8  10   12   14   16   18   20   22
          液 100 μL，空白对照组加入等体积培养液。培养 48 h                                           采集时间/min
          后，收集各组细胞，用 RIPA 裂解缓冲液冰浴裂解，离心                       图1 CHCR化学成分UPLC-Q-TOF-MS/MS分析的总
          后收集蛋白，备用。以BCA法进行蛋白定量，将蛋白高                               离子流图


          中国药房  2023年第34卷第8期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 8    · 937 ·
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