Page 41 - 《中国药房》2023年8期
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2.4 肝脏与回肠组织病理形态观察                                  3.2 肝宝胶囊对大鼠血清中脂多糖及炎症因子含量的
              取经固定的肝左叶与回肠组织，脱水、透明、浸蜡、                        影响
          石蜡包埋、切片、HE 染色后，采用显微镜观察肝脏与回                             与空白组比较，模型组大鼠血清中脂多糖、TNF-α、
          肠组织的病理形态变化。                                        IL-6 和 IL-1β 含量均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），表
          2.5 回肠组织中Occludin和ZO-1蛋白表达测定                       明高脂饮食诱导的大鼠 NAFLD 会造成肝脏炎症反应。
                                                             与模型组比较，肝宝组大鼠血清中脂多糖、TNF-α、IL-6
              采用免疫组化法进行检测。取回肠组织切片进行
                                                             和IL-1β含量均显著降低（P＜0.01）。结果见表2。
          脱蜡、复水、修复抗原、封闭、孵育抗体（一抗Occludin和
                                                             表2 各组大鼠血清中脂多糖、TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含
          ZO-1 稀释比均为 1∶200，二抗 IgG 稀释比为 1∶100）、
                                                                  量的测定结果（x±s，n＝8）
          DAB 显色、复染、返蓝、脱水封片后，采用显微镜观察并
                                                              组别     脂多糖/（ng/L）  TNF-α/（pg/mL）  IL-6/（pg/mL）  IL-1β/（pg/mL）
          采集图片。每张切片各选5个不同视野，采用Image J软                        空白组    10.69±0.95  77.51±2.74  60.66±2.92  87.33±5.91
          件分析，以平均光密度值评价 Occludin 和 ZO-1 蛋白表                   模型组    11.80±0.84 a  166.12±4.95 b  249.18±7.42 b  332.24±9.89 b
                                                              肝宝组    10.57±0.98 c  89.41±2.43 c  86.93±3.63 c  120.89±9.18 c
          达水平。
                                                                a：与空白组比较，P＜0.05；b：与空白组比较，P＜0.01；c：与模型组
          2.6 大鼠肠道菌群基因测序
                                                             比较，P＜0.01
              采 用 16S 核 糖 体 RNA（16S  ribosomal  RNA，16S      3.3 肝宝胶囊对大鼠肝脏与回肠组织病理形态的影响
          rRNA）基因测序技术进行检测。取大鼠粪便，采用DNA                            肝脏组织显微图显示，空白组大鼠肝小叶结构清
          提取试剂盒对样本总 DNA 进行抽提，采用超微量分光                         晰，肝细胞大小均匀，肝细胞索排列整齐，细胞核位于中
          光度计对 DNA 进行定量，再通过琼脂糖凝胶电泳分析                         央；模型组大鼠肝细胞内有许多大小不等的脂肪空泡聚
          其质量。用正向引物 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-                    集和气球样变，细胞核被挤向一边，同时伴随着炎症细
          CA-3′，反向引物 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，             胞浸润；与模型组比较，肝宝组大鼠脂肪变性明显减轻，
          产物大小为480 bp，对16S rRNA基因的V3～V4可变区                   几乎恢复至空白组水平。回肠组织显微图显示，空白组
          进行聚合酶链式反应扩增。通过磁珠对扩增产物进行                            大鼠回肠黏膜结构清晰，肠绒毛结构正常，绒毛细胞排
                                                             列整齐、紧密，黏膜上皮完整，固有层腺体细胞结构清
          纯化回收，采用酶标仪进行荧光定量，测序文库制备后
                                                             晰；模型组大鼠肠绒毛明显增厚变短、排列紊乱，肠绒毛
          在Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序。对原始
                                                             上皮不完整、部分坏死脱落，固有层水肿增厚，伴有炎症
          数据进行序列质控、去噪、拼接、去嵌合等处理后，得到
                                                             细胞浸润；肝宝组大鼠回肠组织结构接近空白组，肠绒
          有效数据。使用QIIME2.0软件对操作分类单元（opera‐
                                                             毛上皮结构基本完整，炎症细胞浸润与模型组比较明显
          tional taxonomic units，OTUs）进行韦恩（Venn）、α和β多        减轻。显微图见图1。
          样性、物种注释、菌群结构组成及差异分析。                               3.4 肝宝胶囊对大鼠回肠组织中 Occludin 和 ZO-1 蛋
          2.7 统计学方法                                          白表达水平的影响
              采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析，数据以 x±s 表                    Occludin和ZO-1阳性染色呈棕黄色，主要分布在大
          示，符合正态分布且方差齐的资料组间比较采用单因素                           鼠回肠上皮细胞。与空白组比较，模型组大鼠回肠组织
          方差分析，两两比较采用LSD-t检验；若非正态分布或方                        中 Occludin 和 ZO-1 蛋 白 表 达 水 平 均 显 著 降 低（P＜
          差不齐的资料组间比较采用非参数秩和检验。检验水                            0.01）。与模型组比较，肝宝组大鼠回肠组织中Occludin
          准α＝0.05。                                           和ZO-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。结果见图
          3 结果                                               2、表3。
                                                             3.5 肝宝胶囊对大鼠肠道菌群结构和组成的影响
          3.1 肝宝胶囊对大鼠肝功能和血脂指标的影响
                                                             3.5.1 OTUs的Venn分析 通过3组样本OTUs的Venn
              与空白组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST和TG
                                                             分析，共检测到 29 025 个 OTUs，其中 3 组共有的 OTUs
          含量均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，肝宝组大
                                                             为137个。空白组、模型组、肝宝组分别有11 917、7 135、
          鼠血清中 ALT、AST 和 TG 含量均显著降低（P＜0.01）。
                                                             11 687个OTUs，各组独有的OTUs分别为11 392、5 641、
          结果见表1。                                             10 415 个，可见造模后大鼠肠道菌群 OTUs 数量明显减
          表1 各组大鼠血清中 ALT、AST 和 TG 含量的测定结                     少，经肝宝胶囊干预后OUTs数量明显增加，说明各组间
               果（x±s，n＝8）                                    菌群OTUs存在明显差异。
          组别         ALT/（U/L）       AST/（U/L）   TG/（mmol/L）  3.5.2 肠道菌群的稀释曲线和 Rank-Abundance 曲线分
          空白组        54.18±4.77      90.36±3.73  1.05±0.08   析 如图 3A 所示，各组大鼠肠道菌群的稀释曲线先上
          模型组       116.37±8.12 a   201.59±11.77 a  3.45±0.17 a
          肝宝组        67.67±3.05 b   103.26±6.38 b  1.16±0.07 b  升后趋于平坦，即更多的数据量只会产生很少量新的物
             a：与空白组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01                 种，表明测序深度足够。如图3B所示，各组大鼠肠道菌


          中国药房  2023年第34卷第8期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 8    · 931 ·
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