Page 29 - 《中国药房》2023年8期
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2 方法与结果                                            2.3 大鼠药代动力学实验及样品处理
          2.1 色谱条件与质谱条件                                      2.3.1 给药及取材 6只雄性SD大鼠，给药前禁食12 h，

          2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent ZORBAX C18 （2.1            自由饮水。阿托伐他汀钙片与含 2% 二甲基亚砜、35%
          mm×50 mm，5 μm），前置粒径为2 μm的在线滤器，柱温                   聚乙二醇400和2%吐温-80的纯净水混合溶解后，以10
          为30 ℃；流动相A相为水-甲醇-乙腈[9∶0.5∶0.5，（V/V/V），             mg/kg灌胃给药。于给药前和给药后0.08、0.33、0.67、1、
          含0.05%甲酸]，B相为甲醇-乙腈[1∶1（V/V），含0.05%甲                2、4、6、8 h时从大鼠眼后静脉丛取血约0.15 mL，至预加
          酸]，梯度洗脱（程序为0～0.3 min，48%B～100%B；0.3～               肝素离心管中。大鼠在取血2 h后自由进水，4 h后自由
          1.6  min，100%B；1.6～5.0  min，48%B）；流 速 为 0.35       进食。取出全血摇匀后马上放入冰盒中，在 4 ℃、3 500
          mL/min；进样盘温度为4 ℃，进样量为4 μL。                         r/min下离心10 min，分离上层血浆，置于－35 ℃冰箱冻
          2.1.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（electron                     存待分析。
          spray ionization，ESI），正离子检测模式；气帘气体为 20             2.3.2 样本前处理 冻存血浆样品在 37 ℃下解冻，精

          psi；源内温度为 500 ℃；源内气体 GS1 为 40 psi，源内气              密分取50 μL样品加入10%甲酸溶液2 μL，再加入内标
          体 GS2 为 40 psi；离子喷射电压（IS）为 5 000 V；碰撞气             溶液 50 μL 和乙腈 150 μL，涡旋 2 min，在 12 000 r/min、
                                                             4 ℃下离心5 min，分取上清液进样分析。
         （CAD）为 中（Medium）；扫 描 方 式 选 择 多 反 应 监 测
                                                             2.4 方法学考察
         （multi-reaction monitoring，MRM）模式，用于定量分析的
                                                             2.4.1 专属性 取空白大鼠血浆 50 μL，除用 50 μL 甲
          各待测成分母离子和子离子及对应的去簇电压、碰撞电
                                                             醇代替内标外，其余操作同“2.3.2”项下方法处理后，再
          压和出口电压见表1。
         表 1 待测成分和内标的定量分析离子对及主要质谱                            按“2.1”项下条件进样分析。按“2.2.1”项下方法操作，配
               参数                                            制 ATV、ATL、2-HAT、4-HAT 浓度分别为 0.5、0.5、0.25、
          待测成分/内标  母离子m/z   子离子m/z   去簇电压/V  碰撞电压/V  出口电压/V  0.063 nmol/L 的标准血浆样品，再按上述方法处理后进
          ATV       559.3     440.2   106     31     12      样分析。取“2.3.1”项下给药 0.33 h 后大鼠血浆样品，再
          2-HAT     575.2     440.3    91     33     14
          4-HAT     575.0     440.2    91     33     12      按上述方法处理后进样分析。结果显示，ATV、ATL、
          ATL       540.9     448.2    91     25     14      2-HAT、4-HAT、PIV 的保留时间分别为 3.0、3.1、2.9、1.5、
          PIV       422.2     290.0   121     39     16
                                                             1.3 min，表明空白血浆的内源性物质不干扰ATV及代谢
          2.2 溶液的制备
                                                             产物 ATL、2-HAT、4-HAT 及内标 PIV 的测定，且给药后
          2.2.1 标准血浆样品 精密称量ATV、PIV对照品各10
                                                             生物样品和标准血浆样品在相同位置出峰，说明该分析
          mg，ATL、2-HAT、4-HAT 对照品各 1 mg，分别加甲醇溶
                                                             方法对待测成分的分析专属性好。结果见图1。
          解后定容，制成质量浓度为1 mg/mL储备液。取不同体积
                                                             2.4.2 标准曲线、定量下限和检测限 取“2.2.1”项下标
          的ATV、ATL、2-HAT和4-HAT储备液混匀，加甲醇稀释，
                                                             准血浆样品按照“2.3.2”项下方法处理，再按“2.1”项下条
          得ATV和2-HAT浓度均为5 120 nmol/L、ATL和4-HAT浓              件进样分析，每种浓度平行制备5份。以待测成分与内
          度均为 640 nmol/L 的混合标准溶液。精密吸取空白大                     标的峰面积的比值为纵坐标（Y），待测成分浓度为横坐
          鼠血浆450 μL，加入50 μL混合标准溶液混匀作为标准                      标（X）进行线性回归，权重因子为1/y 。线性回归分析结
                                                                                            2
          曲线上限血浆样品，再以空白血浆逐级等比稀释2倍获                           果显示，各待测成分线性关系良好（r＞0.99）。各待测成
          得 ATV、2-HAT、4-HAT 和 ATL 的浓度范围分别为 0.5～              分的标准曲线、定量下限和检测限见表2。
          512、0.5～512、0.25～64、0.063～64 nmol/L 的标准血浆             表2 各待测成分的标准曲线、定量下限和检测限
          样品。                                                 待测成分    标准曲线      r  线性范围/（nmol/L） 定量下限/（nmol/L） 检测限（S/N＝3）
          2.2.2 质量控制样品 取大鼠空白血浆，外加“2.2.1”项                     ATV  Y＝0.020 9X+0.002 87  0.996  0.5～512  0.5  0.030
                                                              2-HAT  Y＝0.017 2X+0.002 36  0.997  0.5～512  0.5  0.041
          下的混合标准溶液，配制成 ATV 和 2-HAT（浓度均为                       4-HAT  Y＝0.011 0X+0.000 72  0.998  0.25～32  0.25  0.052
          0.5、1、16、384 nmol/L）、4-HAT（浓度为 0.25、0.5、4、48        ATL  Y＝0.016 9X+0.000 77  0.994    0.063～16  0.006 3  0.015

          nmol/L）、ATL（浓度为 0.063、0.13、2、48 nmol/L）的质量         2.4.3 精密度和准确度 取“2.2.2”项下的 QC 样品，按
          控制（QC）样品。                                         “2.3.2”项下方法平行制备 6 份样本，测定 3 d，根据当日
          2.2.3 内标溶液 取PIV储备液，用甲醇稀释为25 ng/mL                  标准曲线，分别计算 QC 样品的测定浓度。以相对标准
          的内标溶液。                                             误差（RSD）来评价测定方法的批内和批间精密度，以相


          中国药房  2023年第34卷第8期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 8    · 919 ·
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