Page 89 - 《中国药房》2023年3期
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动物使用许可证号为 SYXK（粤）2020-0109。饲养条件                    4、6分的病变严重程度介于相应分数之间 。
                                                                                                [15]
          为环境温度 20～24 ℃，相对湿度 50%～70%，明暗交替                    2.1.6 血清及肺组织中炎症指标检测 取“2.1.3”项下
          各 12 h。所有动物实验流程均通过中山市中医院动物                         血清，常规解冻后按照ELISA试剂盒说明书检测血清中
          伦理委员会审核，批准文号为AEWC-2022034。                         TGF-β1、TNF-α 水平；取右肺组织，加入磷酸盐缓冲液
          1.4 细胞株                                           （PBS）制备组织匀浆，按照ELISA试剂盒说明书检测肺
              人胚肺成纤维细胞HFL1购自武汉普诺赛生命科技                        组织匀浆中IL-6水平。
          有限公司（货号CL-0106）。                                   2.1.7 肺组织中ERK及炎症相关通路蛋白表达检测 采
          2 方法                                               用免疫组化法进行检测。制备小鼠肺组织切片（厚度 3
          2.1 体内实验                                           μm），常规脱蜡及处理后，分别加入 TGF-β1、α-SMA、
          2.1.1 动物分组、造模及给药 将小鼠适应性饲养 1 周                      Collagen Ⅰ、p-ERK1/2抗体（稀释比例均为1∶200），按照
          后，按体质量大小采用区间随机分组法分成正常组、模                           试剂盒说明方法操作，封片后显微镜观察，采集图像并
          型组、蒙花苷低剂量组、蒙花苷高剂量组和阳性对照组，                          进行分析。以棕黄色颗粒沉积为阳性表达，用 Image-

          每组 8 只。除正常组外，其余各组小鼠均腹腔注射 1%                        Pro Plus 6.0软件计算各蛋白的平均光密度值。
          戊巴比妥钠麻醉，然后将其固定于操作台上，通过微量                           2.2 体外实验
          液体气管内雾化装置迅速给予每只小鼠50 μL博莱霉素                         2.2.1 细胞培养 将 HFL1 细胞接种于 HFL1 细胞专用
                                        [14]
         （剂量为3 mg/kg）制备肺纤维化模型 ；正常组小鼠则以                       培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每隔3 d进
          同样方式给予等体积生理盐水。造模 24 h 后，蒙花苷                        行传代换液1次，保证细胞活力为最佳状态。
          低、高剂量组小鼠灌胃 12.5、25 mg/kg 蒙花苷（溶剂为                   2.2.2 细胞形态学观察 取处于对数生长期且状态良
          0.5%羧甲基纤维素钠溶液，剂量根据预实验结果设置），                        好的HFL1细胞接种于6孔板中，每孔细胞数约为1×10                    5
          阳性对照组小鼠灌胃 200 mg/kg 吡非尼酮（溶剂为 0.5%                  个，常规培养，次日贴壁后，将细胞分为空白组、模型组
          羧甲基纤维素钠溶液，剂量为临床等效剂量），正常组和                          和蒙花苷低、中、高浓度组。其中，空白组加培养基；模
          模型组小鼠灌胃等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液。每日                         型组加入 TGF-β1 （10 ng/mL）溶液刺激形成肺纤维化细
                                                                   [16]
          给药1次，连续14 d。实验过程中，小鼠自由饮水及进食。                       胞模型 ；蒙花苷低、中、高浓度组分别加入 3.7、7.4、
          2.1.2 小鼠一般情况观察 实验过程中，每天观察各组                        14.8 mg/L蒙花苷（质量浓度根据预实验结果设置），同时
          小鼠的活动、毛发、饮食、体质量等一般情况。                              加入TGF-β1 （10 ng/mL）溶液。培养48 h后，于倒置显微
          2.1.3 取材 末次给药前，记录各组小鼠的体质量。末                        镜下拍照并观察HFL1细胞的形态学变化。
          次给药2 h后，麻醉小鼠并摘眼球取血，将得到的全血在                         2.2.3 细胞中 ERK 及炎症相关通路蛋白表达检测 采
          4 ℃条件下静置 2 h，然后以 3 500 r/min 离心 15 min，收           用 Western blot 法进行检测。HFL1 细胞的接种、分组及
          集上层血清，将其冻存于－80 ℃冰箱中待测。采血后，                         给药方式均同“2.2.2”项下。培养结束后加入RIPA裂解
          处死小鼠，并解剖剥离其肺组织。                                    液裂解细胞，离心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），收集上清
          2.1.4 肺指数测定 称定剥离得到的干净肺组织的质                         液，采用BCA法测定上清液中总蛋白浓度，加入Loading
          量，按下列公式计算小鼠肺指数：肺指数（mg/g）＝肺质                        buffer，96 ℃金属浴煮 10 min 使蛋白变性。采用十二烷
          量（mg）/末次给药前小鼠体质量（g）。                               基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白组分（电压
          2.1.5 肺组织病理学检查 取各组小鼠左肺组织适量，                        70～120 V，时间 1.5 h），湿转法将蛋白转移到聚偏二氟
          置于福尔马林溶液中固定24 h，经脱水、石蜡包埋、切片                        乙烯膜上（恒流300 mA，时间2 h），用5%脱脂奶粉封闭
         （厚度4 μm）后，常规进行苏木精-伊红（HE）染色和Mas‐                     2 h，以PBST洗膜3次；加入α-SMA、Collagen Ⅰ、ERK1/2、
          son 染色，使用光学显微镜观察肺组织病理形态并采集                         p-ERK1/2和GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃
          图像。参照 Ashcroft 评分标准分别进行肺纤维化评分，                     孵育过夜，以 PBST 洗膜 3 次；加入二抗（稀释比例为 1∶
          评分越高表明肺纤维化程度越严重：0 分——正常肺组                          10 000），室温孵育 2 h。采用化学发光成像系统曝光并
          织；1 分——肺泡壁或支气管壁轻微增厚；3 分——肺泡                        拍照，采用 Image-Pro Plus 6.0 软件分析蛋白条带灰度
          壁或支气管壁中度增厚，但肺泡结构没有明显破坏；5                           值，以p-ERK1/2蛋白与ERK1/2蛋白条带灰度值的比值
          分——条索状纤维带或小范围纤维灶形成，肺泡结构明                           表示 p-ERK1/2 蛋白的表达水平，其余则以目的蛋白与
          显破坏；7 分——肺泡结构严重变形，广泛的纤维灶形                          内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表示目的蛋白的
          成，呈“蜂窝肺”；8 分——肺组织全视野纤维化病变；2、                       表达水平。实验重复3次。


          中国药房  2023年第34卷第3期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 3    · 335 ·
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