Page 32 - 《中国药房》2023年2期

养 2 h 后，将细胞培养板按 400 r/min 离心 5 min，分别取 入 PI 染液混匀，室温避光染色 15 min，用流式细胞仪检
各孔的上清液 120 μL 加入到新的 96 孔板相应孔内，每 测 。结果显示，Sham组仅有少数细胞凋亡；与Sham组
[13]
孔再加 60 μL LDH 检测工作液，混匀，室温避光孵育 30 比 较 ，Model 组 细 胞 凋 亡 率 显 著 升 高（P＜0.05）；与

min 后，于 490 nm 处测定吸光度，并计算细胞毒性。细 Model组比较，Cur-SLN-FL处理组的细胞凋亡率均显著
胞毒性（%）＝（处理样品孔吸光度－样品对照孔吸光 降低（P＜0.05），提示 Cur-SLN-FL 处理可减轻由 LPS 引
度）/（样品最大酶活性对照孔吸光度－样品对照孔吸光 起的细胞凋亡。结果见表5和图6。
度）×100%。 表5 Cur-SLN-FL对BEAS-2B细胞早期凋亡率及线粒
结果显示，经 Cur-SLN-FL 处理 2 h 后，BEAS-2B 细 体膜电位的影响（x±s，n＝5）
胞的增殖受到抑制，细胞的 LDH 释放量随着 Cur-SLN- 组别 细胞凋亡率/% 线粒体膜电位
Sham组 4.000±0.283 64.900±5.798
FL质量浓度的增加而增加，且具有量效关系。经计算， Model组 23.533±1.290 a 31.500±8.485 a
Cur-SLN-FL的半数致死量（LD50 ）为5.809 mg/mL。而空 Cur-SLN-FL-H组 11.550±0.495 b 50.750±1.626 b
Cur-SLN-FL-L组 15.200±2.404 b 62.800±5.374 b
白 SLN-FL 浸提液按照《GB/T 16886.5-2017 医疗器械生 Budesonide组 16.350±5.162 65.850±2.051 b
物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》规定的细胞毒性 a：与Sham组比较，P＜0.05；b：与Model组比较，P＜0.05

检测方法进行检测，其LD50为3.908 mg/mL。 2.5.6 Cur-SLN-FL对BEAS-2B细胞线粒体膜电位的影
2.5.5 Cur-SLN-FL 对 BEAS-2B 细 胞 早 期 凋 亡 的 影 响 采用 JC-1 试剂盒检测线粒体膜电位。将 BEAS-2B
响 采用 Annexin Ⅴ/PI 双染法进行检测。将 BEAS-2B 细胞悬液接种于 6 孔板中，贴壁后按“2.5.5”项下分组处
细胞悬液接种于 6 孔板，待细胞贴壁后将其分为 Sham 理 24 h 后，收集细胞，用 PBS 洗涤 2 次，以 2 000 r/min 离
组、Model组、Cur-SLN-FL-H组（0.25 mg/mL）、Cur-SLN- 心 5 min。按说明书配制 JC-1 荧光探针检测工作液，每
FL-L 组（0.125 mg/mL）和 Budesonide 组（2.5 μg/mL），参 孔细胞用500 μL工作液悬浮均匀，于37 ℃、5%CO2避光
考细胞毒性实验结果和文献[12]设置给药剂量。除 染色20 min。经2 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，
Sham 组外，各组均加入含 LPS（50 μg/mL）的培养液培 收集细胞，用 PBS 洗涤 2 次，每孔用 500 μL 稀释后的培
[13]
养24 h后，Sham组、Model组加入同体积的培养液，给药 养缓冲液重悬细胞后，用流式细胞仪检测 。结果，与
组分别加入对应剂量的药液，继续培养 24 h 后消化，加 Sham 组比较，Model 组的线粒体膜电位显著下降（P＜
入含10%胎牛血清的DMEM培养基，中和胰酶，终止消 0.05），而 Cur-SLN-FL 处理组和 Budesonide 组的线粒体

化，反复吹打使细胞脱落；以 2 000 r/min 离心 5 min 后， 膜电位较 Model 组显著升高（P＜0.05），表明 Cur-SLN-
弃上清液，用 PBS 洗涤 2 次；再次离心 5 min，弃上清液， FL 可以通过调节线粒体膜电位减轻 LPS 引起的 BEAS-
采用PBS悬浮细胞，加入Annexin Ⅴ染色液混匀后再加 2B细胞凋亡。结果见表5和图7。

10 5 10 5 10 5 10 5 10 5
10 4 10 4 10 4 10 4 10 4
PE-A PE-A PE-A PE-A PE-A
10 3 10 3 10 3 10 3 10 3
10 2 10 2 10 2 10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FITC-A FITC-A FITC-A FITC-A FITC-A
A. Sham组 B. Model组 C. Cur-SLN-FL-H组 D. Cur-SLN-FL-L组 E. Budesonide组
Q1：坏死细胞；Q2：晚期凋亡细胞；Q3：活细胞；Q4：早期凋亡细胞
图6 Cur-SLN-FL对BEAS-2B细胞早期凋亡率影响的流式细胞图
10 5 10 5 10 5 10 5 10 5
10 4 10 4 10 4 10 4
10 4
PE-A 10 3 PE-A 10 3 PE-A 10 3 PE-A 10 3 PE-A 10 3
10 2 10 2 10 2
10 2 10 2
10 1 0 10 1 0 10 1
3
2
10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 0 10 10 10 10 5 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 0 10 10 10 10 5 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5
4
4
2
3
FITC-A FITC-A FITC-A FITC-A FITC-A
A. Sham组 B. Model组 C. Cur-SLN-FL-H组 D. Cur-SLN-FL-L组 E. Budesonide组
图7 Cur-SLN-FL对BEAS-2B细胞线粒体膜电位影响的流式细胞图
· 154 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 2 中国药房 2023年第34卷第2期