Page 24 - 《中国药房》2023年2期
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MXF低、中、高剂量组每个粪便样本中称取相同质量的                           中剂量组小鼠第 3～5 天、MXF 高剂量组小鼠第 2～7 天
          粪便样品，置于同一容器中，混合均匀，按照“2.4.1（2）”                      体质量显著低于空白组（P＜0.05）。与空白组相比，各
          项下供试品溶液制备方法制备QC样本溶液。                                给药组小鼠的肛温差异均无统计学意义。给药第2天，
          2.4.2 色谱条件与质谱条件 （1）色谱条件：色谱柱为                        MXF 中、高剂量组有小鼠死亡，生存率分别为 58.33%、
          HALO-C18 （2.1 mm×100 mm，2.7 μm），以 0.05% 甲酸溶         50.00%，后续指标检测按代谢组学样本数量的最低要求
          液为流动相 A、0.05% 甲酸乙腈溶液为流动相 B 进行梯                      进行，每组6只。结果见图1和图2。
          度 洗 脱（0～5  min，5%B→10%B；5～15  min，10%B→                                                 空白组
                                                                    24
          40%B；15～25 min，40%B→98%B；25～26 min，98%B→                                                MXF低剂量组
                                                                                         a    a   MXF中剂量组
          100%B；26～28  min，100%B；28～29  min，100%B→                  22                 a          MXF高剂量组
          5%B；29～32 min，5%B），柱温为 30 °C，进样量为 5 μL，                  体质量/g        a  a b  b
          流速为 0.3 mL/min。（2）质谱条件：采用正、负离子扫描                          20    a     b
          模式进行检测。离子源为电喷雾电离源（ESI），毛细管
                                                                    18
          电压为 3.5 kV，毛细管温度为 350 ℃，鞘气为 45 arb，辅                          1   2   3   4   5   6   7
                                                                                 时间/d
          助气为 10 arb，源内温度为 350 ℃，质谱采集范围为 m/z                                  A.体质量变化
          50～1 500，分辨率为70 000。                                      39                            空白组
          2.4.3 样本检测 为保障样本数据采集的重现性与质                                38                            MXF低剂量组
                                                                                                  MXF中剂量组
          谱仪器的稳定性，在检测序列中每6个样本添加1个QC                                                               MXF高剂量组
          样本。将正、负离子模式下采集的所有样本数据连同                                  肛温/℃  37
          QC 样 本 数 据 进 行 主 成 分 分 析（principal  component             36
          analysis，PCA），判断仪器的稳定性。                                   35
          2.5 数据处理                                                      1   2   3   4   5   6   7
                                                                                 时间/d
          2.5.1 统计学方法 毒性作用指标采用SPSS 20.0软件                                       B.肛温变化
          进行单因素方差分析，数据以x±s表示。检验水准α＝                              a：MXF高剂量组与空白组相比，P＜0.05；b：MXF中剂量组与空
                                                              白组相比，P＜0.05
          0.05。采用 GraphPad Prism 9.0 软件进行小鼠生存率
                                                                      图1 各组小鼠体质量和肛温变化图
          分析。
          2.5.2 粪便代谢组学数据处理方法 粪便代谢组学原                                                              空白组
                                                                    100                           MXF低剂量组
          始数据转换后首先采用R语言软件进行色谱峰识别、对                                                                MXF中剂量组
          齐等处理，参数设定使用默认数值，并采用修正 80% 规                                                             MXF高剂量组
          则去除缺失值，得到一个保留时间、m/z和峰强度的三维                               生存率/%  50
          数据矩阵；将得到的数据导入SIMCA-P 17.0软件进行数
          据的降维和标准化处理，采用无监督的PCA和有监督的                                  0
                                                                      0     2     4     6     8
          正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least                                 时间/d
          squares-discriminant analysis，OPLS-DA）对数据进行分                   图2 各组小鼠生存率变化图
          析，以投影变量重要性（variable importance for the pro‐
                                                              3.2 小鼠脏器指数的检测结果
          jection，VIP）值＞1、方差分析中 P＜0.05、倍数变化（fold
                                                                  与空白组相比，各给药组小鼠的心指数、肝指数、肾
          change，FC）＞1为条件，筛选得到潜在生物标志物。
                                                              指数、精囊腺指数差异均无统计学意义；各给药组小鼠
          2.5.3 生物标志物鉴定及代谢通路分析 将“2.5.2”项
                                                              的脾指数、肺指数、肾上腺指数均显著升高，胸腺指数显
          下获得的潜在生物标志物的保留时间、精确 m/z 以及同
                                                              著降低（P＜0.05）；MXF低、高剂量组小鼠的睾丸指数均
          位素比例等信息输入在线数据库 METLIN（https：//met‐
                                                              显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
          lin.scripps.edu）、HMDB（https：//hmdb.ca）进行标志物的
                                                              3.3 血清生化指标检测结果
          检索和鉴定，使用KEGG数据库（https：//kegg.jp）进行代
                                                                  与空白组相比，各给药组小鼠的心肌功能指标 CK
          谢通路分析。
                                                              水平显著升高（P＜0.05），MXF 低剂量组的 CK-MB/CK
          3 结果                                                比值显著降低（P＜0.05）；MXF 中剂量组的心肌功能指
          3.1 小鼠体质量、肛温和生存率的测定结果                               标α-HBDH、LDH 水平均显著升高（P＜0.05），肝功能指
              灌胃7 d内，空白组小鼠体质量持续增长，肛温维持                        标ALP水平显著降低（P＜0.05）；MXF中、高剂量组的肾
          在36～39 ℃范围内，相对稳定。与空白组相比，MXF低                        功能指标尿素水平显著升高（P＜0.05），CYS-C 水平显
          剂量组小鼠体质量增长缓慢，差异无统计学意义；MXF                           著降低（P＜0.05）。结果见表2～表4。


          · 146 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 2                               中国药房  2023年第34卷第2期
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