Page 19 - 《中国药房》2023年2期

min记录给药前收缩力，给药后设定检测程序：前2 h，每 0.1%DMSO 或舒尼替尼（3.14 μmol/L）孵育 24 h，采用
10 min 检测 1 次收缩信号，观察舒尼替尼对 hiPSC-CMs CardioExcyte 96系统检测各组细胞的收缩力。
收缩力的急性抑制作用；给药 2 h 后，系统每 1 h 记录 1 2.7 统计学方法
次数据，记录至给药 24 h 时，然后拟合舒尼替尼抑制 采用 GraphPad Prism 7、SPSS 20.0、Adobe Illustrator
hiPSC-CMs 收缩力的半数抑制浓度（half inhibitory con‐ CS5 进行图像处理及数据分析，实验数据用 x±s 表示。

centration，IC50 ）。 对服从正态分布和方差齐性的数据，多组间比较采用单
2.3 舒尼替尼对hiPSC-CMs收缩频率的影响考察 因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s post hoc检
将 hiPSC-CMs 复苏，按 30 000 个/孔接种于 NSP-96 验。对不服从正态分布的数据，采用 Mann-Whitney 非
型 电 极 孔 板（经 纤 连 蛋 白 铺 底），分 为 对 照 组 参数检验。检验水准α＝0.05。
（0.1%DMSO）和舒尼替尼组（3.14 μmol/L，根据“2.2”项 3 结果
下结果设置）。采用CardioExcyte 96系统检测给药/溶剂 3.1 舒尼替尼对hiPSC-CMs收缩力的影响
前30 min及给药/溶剂后24 h各组细胞的收缩频率。 由图1可知，给药24 h后，阿霉素显著减弱了hiPSC-
2.4 舒尼替尼对hiPSC-CMs钙瞬变幅度和钙瞬变恢复 CMs 的收缩力（P＜0.05），而阿西替尼对 hiPSC-CMs 收
时程的影响考察 缩力并无显著影响（P＞0.05），这表明检测系统敏感。
将 hiPSC-CMs 复苏，按 10 000 个/孔接种于 48 孔板 由图2可知，舒尼替尼对hiPSC-CMs 收缩力的抑制作用
（提 前 放 入 6 mm 的 玻 璃 小 片）内 ，分 为 对 照 组 有浓度依赖趋势，且当舒尼替尼浓度≥1 μmol/L 时，
（0.1%DMSO）和舒尼替尼组（3.14 μmol/L，根据“2.2”项 hiPSC-CMs收缩力呈明显下降的趋势。经拟合，舒尼替
下结果设置），每组设4个复孔。作用24 h后，取出细胞 尼抑制hiPSC-CMs收缩力的IC50值为3.14 μmol/L。
小片置于氧饱和的有钙台式液中，随后用含 5 μmol/L 20 a
ns
Fluo-4/AM的钙离子荧光探针和0.02%F127的有钙台式
15
液，于 37 ℃避光孵育 20 min；更换有钙台式液后，将各
组细胞于 37 ℃恒温浴槽内持续灌流台式液，通过激光 收缩力/Ω 10
共聚焦显微镜线扫模式记录细胞自发钙瞬变幅度和钙 5
瞬变恢复时程。
0
2.5 舒 尼 替 尼 对 hiPSC-CMs 中 ANP、BNP、β -MHC 阿西替尼 阿西替尼 阿霉素 阿霉素
给药前 给药后 给药前 给药后
mRNA表达水平的影响考察 a：与阿霉素给药前比较，P＜0.05；ns：与给药前比较，P＞0.05
将 hiPSC-CMs 复苏，按 30 000 个/孔接种于 96 孔板 图1 阿西替尼和阿霉素对 hiPSC-CMs 收缩力的影响
中，按“2.3”项下方法分组与干预，每组设4个复孔，作用 [x±s，n＝4（阿西替尼）或n＝3（阿霉素）]
24 h后，提取hiPSC-CMs 总RNA，反转录得到cDNA，以 20
cDNA 为模板进行 PCR。PCR 反应体系（共 20 μL）包
15 a
括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游 b
引物各 0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX 0.4 μL。反应条件为： 收缩力/Ω 10
95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个 5
b
循环。以 GAPDH 为内参，采用 2 －ΔΔCt 法分析目的基因 b
0
mRNA的表达水平。 0 0.5 1 3 5 10
舒尼替尼浓度/（μmol/L）
2.6 PI3K 对舒尼替尼致 hiPSC-CMs 收缩抑制的影响 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与对照组比较，P＜0.01
考察 图2 不同浓度舒尼替尼对 hiPSC-CMs 收缩力的影响

将 hiPSC-CMs 复苏后，按 30 000 个/孔接种于 NSP- （x±s，n＝4）
96 型电极孔板（经纤连蛋白铺底）中，分为对照组、PIP3 3.2 舒尼替尼对hiPSC-CMs收缩频率的影响
组（1 μmol/L，剂量根据预实验设置）、舒尼替尼组（3.14 对照组 hiPSC-CMs 给溶剂前后，差异无统计学意
μmol/L）和舒尼替尼+PIP3 组（3.14 μmol/L 舒尼替尼+ 义。舒尼替尼组给药后，与对照组或给药前比较，
1 μmol/L PIP3），每组设 4 个复孔。PIP3 组和舒尼替 hiPSC-CMs 收 缩 频 率 均 显 著 降 低（P＜0.01）。 结 果
尼+PIP3组细胞提前用PIP3孵育4 h，然后各组再分别用 见图3。

中国药房 2023年第34卷第2期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 2 · 141 ·