Page 18 - 《中国药房》2023年2期
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及生存期    [1―2] 。舒尼替尼是一种多靶点TKIs，研究表明，                 脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3）
          其可导致 28% 的患者出现不同程度的心脏收缩功能障                          购自美国Echelon Biosciences公司（货号P-3917，纯度＞
                                            [3]
          碍，其中 8% 的患者可进展为心力衰竭 。动物研究发                          95.0%）；钙离子荧光探针Fluo-4/AM（货号F14217）购自
          现，舒尼替尼可剂量依赖性地降低小鼠心肌细胞钙瞬                             美 国 Life  Technology 公 司 ；表 面 活 性 剂 F127（货 号
          变幅度，抑制心脏肌张力 ；可通过显著抑制腺苷一磷                            9003-11-6）购自美国 Sigma 公司；反转录试剂盒购自
                                [4]
          酸活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylino‐                 美国 Promega 公司；SYBR PCR Mix 试剂盒购自日本
                                            2+
          sitol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶 A 和 Ca /钙调蛋白依赖            TaKaRa 公司。本研究所用心房钠尿肽（atrial natriuretic
          性蛋白激酶Ⅱδ 等的活性来影响实验动物的心脏功                             peptide，ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和
          能 [5―7] 。目前，舒尼替尼致心脏毒性的确切分子机制尚                       β-肌凝蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）的引物
          不明确，且无特异性的防治策略，导致该药的临床应用                            由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及
              [7]
          受限 。                                                扩增产物长度见表1。
              PI3K是一种进化高度保守的激酶家族，其α、β亚型                                 表1 引物序列及扩增产物长度
                             2+
          均可参与心肌细胞Ca 循环及兴奋收缩偶联，敲除PI3K                         基因                  引物序列（5′→3′）       扩增产物长度/bp
                                      [8]
          α 或 β 编码基因可引发心力衰竭 。由于心肌细胞正常                         ANP       上游：CGTGTCCAACGCAGACCTGATG      118
                                                                        下游：CGCTTCTTCATTCGGCTCACTGAG    118
                   2+
          收缩与Ca 循环密切相关，因此本课题组假设舒尼替尼                           BNP       上游：CTGCTCCTGCTCTTCTTGCATCTG    83
          可通过抑制PI3K活性而引发Ca 调控紊乱，从而导致心                                   下游：TCCAAGTCCGAGGCTGAACCG       83
                                     2+
                                                              β-MHC     上游：AGACAGTGACCGTGAAGGAGGAC     147
          脏收缩功能障碍。人源诱导型多能干细胞来源的心肌
                                                                        下游：TGTAGATCATCCAGGAGCCGTAGC    147
          细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardio‐  GAPDH  上游：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT      197
          myocytes，hiPSC-CMs）具有人类心肌细胞的基本功能及                             下游：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG     197
          特点（如心肌细胞的信号调控、离子通道及通道蛋白转                            1.3 实验细胞
          运等），同时能够对药物或电生理刺激作出心肌细胞样                                hiPSC-CMs购自北京赛贝生物技术有限公司。
          反应，是目前评价药物致心肌细胞电生理功能障碍和开                            2 方法
          展心血管疾病研究、药物临床前毒性监测的重要细胞模                            2.1 hiPSC-CMs的培养
            [9]
          型 。基于此，本研究以舒尼替尼诱导 hiPSC-CMs 建立                          细胞复苏后，分别按 30 000、10 000 个/孔接种至
          收缩功能障碍细胞模型，探讨PI3K在此过程中的作用，                          NSP-96 型电极孔板（经纤连蛋白铺底）和 48 孔板（提前
          为TKIs等抗肿瘤药物的心脏毒性机制研究和药物临床                           放入6 mm的玻璃小片）内，混匀，常温下放置30 min后，
          前心脏毒性风险筛查提供参考。                                      于 37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。待细胞铺板复
          1 材料                                                苏 48 h 后，吸弃上清液，加入 hiPSC-CMs 完全培养基。
          1.1 主要仪器                                            在给药前，每 24 h 更换一半培养基。预实验显示，在复
              本研究所用主要仪器包括 CardioExcyte 96 型非标                 苏 5 d 后，细胞电信号逐渐达到平台期，可进行后续
          记心脏安全评价系统、NSP-96型电极孔板（德国Nanion                      实验。
          Technology 公司），TCS SP5-Ⅱ型激光共聚焦显微镜系                  2.2 舒尼替尼对hiPSC-CMs收缩力的影响考察
          统（德国Leica公司），HF90型CO2恒温细胞培养箱（上海                         阿霉素和阿西替尼采用二甲基亚砜（DMSO）配制
          力申科学仪器有限公司），NanoDrop 100 型微量核酸蛋                     成 1 mmol/L 的母液，舒尼替尼采用 DMSO 分别配制成
          白检测仪（美国 Genentech 公司），TU-1800 型分光光度                 0.5、1、3、5、10 mmol/L 的母液，PIP3 采用高压灭菌水配
          计（北京普析通用仪器有限责任公司），DW-86L388L                        制成 1 mmol/L 的母液，上述母液均于－20 ℃保存。根
          型－80 ℃生物冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公                            据预实验结果，将阿霉素和阿西替尼的给药浓度设为
          司）等。                                                1 μmol/L，分别在给药前和孵育24 h后，采用CardioExcyte
          1.2 主要药品与试剂                                         96系统检测2种药物对hiPSC-CMs收缩力的影响，以验
              hiPSC-CMs 完全培养基购自北京赛贝生物技术有                      证检测系统的敏感性。
          限公司；苹果酸舒尼替尼原料药（货号 HY-10255，纯度                           将hiPSC-CMs按30 000个/孔接种于NSP-96型电极
          99.60%）、阴性对照阿西替尼原料药（货号 HY-10065，纯                   孔板（经纤连蛋白铺底）中，然后以不同浓度[0（对照，含
          度 99.60%）均购自美国 MedChemExpress 公司；阳性对                0.1%DMSO溶剂）、0.5、1、3、5、10 μmol/L，根据本课题组
          照阿霉素原料药（货号 25316-40-9，纯度＞95.0%）购自                   前期预实验设置]舒尼替尼干预，每个浓度平行设置4个
          东京化成工业株式会社；PI3K的激活剂3，4，5-三磷酸磷                       复孔。采用 CardioExcyte 96 系统进行检测，给药前 30


          · 140 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 2                               中国药房  2023年第34卷第2期
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