Page 20 - 《中国药房》2023年1期
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标记的 Aβ）避光染色 4 h；染色结束后，摄取组细胞用                       （终浓度为 5 μmol/L）。培养 24 h 后，用 Trizol 法提取细
          Hoechst 33342 对细胞核进行染色，经磷酸盐缓冲液                      胞总 RNA，测定其纯度及浓度后，按照逆转录试剂盒方
         （PBS）清洗后在激光共聚焦荧光显微镜下拍照，观察                            法进行逆转录得到 cDNA。以 cDNA 为模板进行 PCR，
          BV2细胞对Aβ的摄取作用。降解组细胞以500 nmol/L                      以 β-actin 为内参，采用 2   －ΔΔCt 法计算目的基因的表达水
          FAM-Aβ避光染色4 h后，更换为MEM完全培养基继续                        平。PCR引物序列及扩增产物长度见表1。
          培养 6 h，用 Hoechst 33342 和溶酶体绿色荧光探针分别                         表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          对细胞核及溶酶体进行染色，经PBS清洗后在激光共聚                           基因           引物序列（5′→3′）               扩增产物长度/bp
          焦荧光显微镜下观察BV2细胞对Aβ的降解作用。                             Lxra         上游：CCTTCCTCAAGGACTTCAGTTACAA  98
                                                                           下游：CATGGCTCTGGAGAACTCAAAGAT
          2.5 EEAM 对 HEK293 细胞中 PPAR-γ 萤光素酶转录
                                                              Lxrb         上游：AAGGACTTCACCTACAGCAAGGA   78
          活性的影响                                                            下游：GAACTCGAAGATGGGATTGATGA
              萤光素酶报告基因是转录活性测定的常用工具之                           Abca1        上游：ACCCACCCTATGAACAACATGA   123
          一，萤光素酶催化底物产生化学发光，萤光素酶表达量                                         下游：GAGTCGGGTAACGGAAACAGG
                                                              Abcg1        上游：AAGGCCTACTACCTGGCAAAGA    69
          越高，化学发光度越强，从而表明目的基因转录活性越
                                                                           下游：GCAGTAGGCCACAGGGAACA
            [14]
          强 。HEK293 细胞是人胚胎肾细胞的细胞系，该细胞                         Apoe         上游：CTCCCAAGTCACACAAGAACTG    77
          具有高度的可转染性，常用作报告基因检测的工具细                                          下游：CCAGCTCCTTTTTGTAAGCCTTT
                                                              Sra          上游：ACGACCCGCCACAATTCTC      166
                                       [16]
            [15]
          胞 。基于此，笔者参考相关文献 ，采用HEK293细胞
                                                                           下游：CTGGAAGCCTTACTTGAAGGAG
          探讨EEAM对PPAR-γ转录活性的影响。取对数生长的                         Cd36         上游：ATGGGCTGTGATCGGAACTG     233
          HEK293细胞接种于96孔板中，待细胞密度达到80%左                                     下游：TTTGCCACGTCATCTGGGTTT
          右时，用 PolyJet 转染试剂进行转染；每孔转染 pCMX-                    β-actin      上游：GGCTGTATTCCCCTCCATCG     241
                                                                           下游：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
          Gal-mPPAR-γ、PPRE-J3-TK-Luc 质粒各 100 ng，并于转
          染6 h后更换为DMEM完全培养基。次日，将转染后的                          2.8 统计学方法
          细胞分为空白对照组、阳性对照组（1 μmol/L罗格列酮）                           所有数据采用 GraphPad Prism 6.0 软件进行统计分
          和EEAM低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每组设                析，计量资料均以x±s表示。多组间比较采用单因素方
          置6个复孔。分别给予相应药物培养24 h后，采用多功                          差分析，组间两两比较采用 Student’s t 检验。检验水准
          能酶标仪检测各孔萤光素酶活性。此外，取对数生长的                            α＝0.05。
          HEK293 细胞按上述方法接种、转染后，给予高剂量                          3 结果
         （0.5 mg/mL）EEAM处理后，分别培养6、12、18、24 h时，                3.1 EEAM对BV2细胞活力的影响结果
          同上述方法检测萤光素酶活性。                                          EEAM 低 、中 、高 剂 量 组 细 胞 存 活 率 [ 分 别 为
          2.6 EEAM对BV2细胞中PPAR-γ核移位的影响                        （103.76±7.58）%、（111.27±6.05）%、（109.54±7.32）%]
              采用免疫荧光法进行实验。将 BV2 细胞接种于提                        与空白对照组[（100.00±10.03）%]比较，差异均无统计
          前加入细胞爬片的24孔板中，按照“2.4”项下方法分组、                        学意义（P＞0.05）。
          培养，每组设3个复孔。24 h后加入4%多聚甲醛固定细                         3.2 EEAM对BV2细胞摄取和降解Aβ的影响结果
          胞 1～2 h，经 PBS 清洗后，用 0.3% Triton-X 室温孵育 30               Aβ摄取实验结果显示，与空白对照组比较，阳性对
          min，以山羊血清封闭2 h，经PBS清洗后，于4 ℃条件下                      照组和 EEAM 中、高剂量组 BV2 细胞中 Aβ 荧光强度均
          以PPAR-γ一抗（稀释度为1∶200）孵育过夜，次日加入二                      显著升高（P＜0.05）。Aβ 降解实验结果显示，与空白对
          抗（稀释比例为 1∶300）室温避光孵育 2 h；加入 Hoechst                 照组比较，阳性对照组和 EEAM 中、高剂量组 BV2 细胞
          33342 染色 30 min，经 PBS 清洗后，取出爬片，采用显微                 中 Aβ 荧光强度均显著降低（P＜0.05），阳性对照组及
          镜观察荧光情况，并用 Image J 软件分析各组细胞中                        EEAM 高剂量组 BV2 细胞中溶酶体荧光强度显著升高

          PPAR-γ蛋白的荧光强度及核移位情况。细胞中PPAR-γ                      （P＜0.05）。结果见图1、图2、表2。
          蛋白荧光强度增强，则表明 PPAR-γ 表达水平升高；另                        3.3 EEAM 对 HEK293 细胞中 PPAR-γ 萤光素酶转录
                                                     [17]
          外，当在细胞核中检测到PPAR-γ，也表明其被激活 。                         活性的影响
          2.7 EEAM 对 BV2 细胞中 PPAR-γ 下游靶基因表达的                      与空白对照组（1.00±0.11）比较，阳性对照组（1.73±
          影响                                                  0.15）和EEAM各剂量组（分别为1.65±0.21、1.65±0.14、
              采用qPCR进行实验。取对数生长期的BV2细胞接                        1.77±0.19）HEK293 细胞中 PPAR-γ 萤光素酶转录活性
          种于6孔板中，培养24 h后，将细胞分为空白对照组、AD                        显著升高（P＜0.05）。另外，以高剂量 EEAM 培养 6、12、
          模型组和EEAM低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5 mg/mL），                18、24 h后，HEK293细胞中PPAR-γ萤光素酶转录活性（分
          每组设置3个复孔。加入相应药物（空白对照组和模型                            别为1.31±0.22、1.44±0.86、1.51±0.16、1.95±0.28）均显
                                                              著升高（P＜0.05），且处理24 h后的转录活性最强。
          组加入培养基），除空白对照组外，其余组也加入 Aβ1-42

          · 14 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 1                                中国药房  2023年第34卷第1期
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