Page 25 - 《中国药房》2023年1期
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是一种在肿瘤表面大量表达的免疫抑制分子，阻断免疫                           serum，FBS）、0.25%胰酶均购自德国Gibco公司；琼脂糖
          检查点 PD-L1/程序性死亡蛋白 1（programmed death-1，            购自北京亚米生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。
          PD-1）可以抑制癌细胞的激活，进而提高肿瘤免疫治疗                         1.3 细胞
                [4]
          的效应 。小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）              小鼠Lewis肺癌细胞LLC购自美国菌种保藏中心。
          是一种长度为21～25 bp的双链RNA，其可通过RNA干                      2 方法和结果
                                                [5]
          扰作用沉默相关基因来达到治疗疾病的作用 。PD-L1                         2.1 脂质体的制备
          siRNA（简称为“siP”）可通过诱导内源性 mRNA 降解来                      （1）采用乙醇注入法制备cRGD修饰的AB4靶向脂
          下调肿瘤细胞中PD-L1的水平，从而激活T淋巴细胞的                         质体（AB4-c-L） 。将 AB4 溶于乙醇中得到浓度为 16
                                                                           [11]
                        [6]
          抗肿瘤免疫活性 。但是游离siP的稳定性差，难以穿透                         mmol/L 的 AB4 乙醇溶液，将 HSPC、DOTAP、胆固醇、
                                   [7]
          生物屏障，且靶向递送效率低 。因此，设计一种可实现                          DSPE-PEG 2000-cRGD、DSPE-PEG 2000（物质的量之比
          靶向递送siP的有效载体具有重要意义。                                为 8.3∶25∶7.2∶0.1∶0.9）溶于上述 AB4 乙醇溶液中，超声
              脂质体是目前研究最多、应用最广的递送系统，可                        （60 ℃，50 kHz，5 min）使其完全溶解，然后缓慢注入到
                          [8]
          改善药物的稳定性 。将 AB4 和 siP 共同包载于脂质体                     2 mL 5% 葡萄糖溶液中，60 °C 水化 1 h，探头超声（300
          囊泡中，有望延长其在体内的循环时间，从而提高其在                           W，10 min）。将所得纳米混悬液置于透析管中，在 5%
          肿瘤组织的分布。环精氨酰甘氨酸天冬氨酸序列[cyclo                        葡萄糖溶液中透析 4 h，经 0.45 μm 滤膜过滤，收集滤
         （Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys），cRGD]是一种可与αβ整合素             液，即得 AB4-c-L。（2）将 DSPE-PEG 2000-cRGD 替换为
                        [9]
          受体结合的环肽 ，而 αvβ3整合素受体在非小细胞肺癌                        DSPE-PEG 2000，同法操作制备未经 cRGD 修饰的载
                                              [10]
          的肿瘤组织和肿瘤血管细胞表面高度表达 。因此，本                           AB4 脂质体（AB4-L）。（3）将所得 AB4-c-L 与 20 nmol/L
          研究首先将 AB4 和 siP 共装载于脂质体中，然后利用                      的siP等体积混合，室温孵育30 min，通过静电吸附得到
          cRGD 可与 αvβ3整合素受体结合的优势，对脂质体进行                      AB4/siP-c-L。（4）使 用 siP 、siP FAM  代 替 siP，同 法 制 备
                                                                                   647
          修饰，制备 AB4 和 siP 共递送 cRGD 修饰靶向脂质体                   AB4/siP -L、AB4/siP -c-L和AB4/siP FAM -c-L。
                                                                    647
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         （AB4/siP-c-L），以提高脂质体的肿瘤主动靶向性，为其                     2.2 AB4/siP-c-L的表征
          后续抗肿瘤研究奠定基础。                                       2.2.1 粒径和 Zeta 电位测定 分别取 AB4-L、AB4-c-L
          1 材料                                               和AB4/siP-c-L混悬液各100 μL，用5%葡萄糖溶液稀释
          1.1 主要仪器                                           至2 mL，混匀，采用激光散射粒径测定仪测定其粒径及
              本研究所用的主要仪器有Gallios型流式细胞仪（美                     Zeta电位。每个样品平行测定3次。结果显示，AB4-L、
          国 Beckman公司），JEM-2100 型高分辨率透射电子显微                  AB4-c-L、AB4/siP-c-L 的平均粒径分别为（180.6±0.3）、
          镜（日本 Jeol 公司），Chemi Doc XRS 型凝胶成像仪、               （190.7±1.2）、（187.4±3.1） nm，Zeta电位分别为（51.4±
          Mini-Sub Cell GT Cell小型水平电泳槽（美国Bio-Rad公            1.3）、（49.2±1.2）、（33.5±1.4） mV。
          司），LSM-710 型共聚焦激光扫描显微镜（德国 Zeiss 公                  2.2.2 形态观察 将 AB4/siP-c-L 混悬液稀释适当倍数
          司），ABI 7500 型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）                    后，取适量滴加于铜网上，静置5 min，用2%磷钨酸染色
          仪（美国Applied Biosystems公司），LC-20AT型高效液相             10 min，晾干，置于透射电子显微镜下观察。结果显示，
          色谱仪（日本 Shimadzu 公司），HC-3018R 型高速冷冻离                AB4/siP-c-L呈类球形，分散良好。结果见图1。
          心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），Nano ZS 型粒
          度测定仪（英国Malvern公司）。
          1.2 主要药品与试剂
              AB4 原料药（批号 2018042505，纯度＞98.0%）购自
          江西本草天工科技股份有限公司；荧光染料Alexa Fluor
                         647
                                                     FAM
          647标记的siP（siP ）、荧光染料FAM标记的siP（siP ）、
          阴性对照siRNA均购自广州锐博生物技术有限公司；氢
          化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-
                                                                       图1 AB4/siP-c-L的透射电镜图
          聚乙二醇（DSPE-PEG 2000）均购自德国 Lipoid GmbH
          公 司 ；二 硬 脂 酰 基 磷 脂 酰 乙 醇 胺 - 聚 乙 二 醇 -cRGD         2.2.3 AB4 包封率和含量测定 采用高效液相色谱法
         （DSPE-PEG 2000-cRGD）购自西安瑞禧生物科技有限公                   测定 AB4 含量。色谱柱为 Diamonsil C18 （250 mm×4.6
          司；（1，2-二油酰基-丙基）-三甲基铵-氯盐（DOTAP）及高                   mm，5  μm），流 动 相 为 乙 腈 - 水（8∶17，V/V），柱 温 为
          纯度胆固醇均购自艾伟拓（上海）医药科技有限公司；                           25 ℃，检测波长为201 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为
          4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自武汉博士德生物                     10 μL。经方法学考察，结果符合 2020 年版《中国药典》
                                                                           [12]
          工程有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清（fetal bovine             （四部）通则要求 。

          中国药房  2023年第34卷第1期                                                  China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 1    · 19 ·
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