Page 19 - 《中国药房》2023年1期
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以进行 多克隆抗体（批号 00105869）购自武汉三鹰生物技术有
性认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病，脑内 限公司；山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号GR3401492-2）
β 淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积是AD的主要 购自美国 Abcam 公司；Aβ1-42、FEEAM-Aβ（批号分别为
病理学特征 [1―2] 。有研究表明，小胶质细胞具有吞噬与 CPC221027110、T2P1000485）均购自苏州强耀生物科技
降解 Aβ 的功能，可以通过降解 Aβ 沉积形成的斑块，发 有限公司；Hoechst 33342、MEM 基础培养基、DMEM 基
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挥保护神经的作用，从而改善 AD 。然而，当小胶质细 础培养基、TriQuick Reagent总RNA提取试剂（批号分别
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胞出现功能障碍时，则可增加 Aβ 沉积，加重 AD 。因 为 20190412、20200716、10013031、229009）均购自北京
此，促进小胶质细胞摄取和降解异常累积的 Aβ 是改善 索莱宝科技有限公司；胎牛血清（批号 12A089）购自上
AD 的有效策略之一 。过氧化物酶体增殖物激活受 海依科赛生物制品有限公司；PolyJet 转染试剂（批号
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体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ） 61758）购自深圳恩科生物科技有限公司；逆转录试剂盒
属于核激素受体超家族，可与 PPAR 反应元件（PPAR （批号 103118190503）购自上海碧云天生物技术有限公
response elements，PPREs）结合，形成一种有效的转录因 司；罗格列酮（批号C10534101，纯度98%）购自阿拉丁试
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子 。PPAR-γ激活后会促进下游基因Abcg1、Sra、Cd36、 剂（上海）有限公司；萤光素酶报告基因检测试剂盒（批
Lxr、Apoe 及 Abca1 的表达，从而增强小胶质细胞对 Aβ 号0000312919）购自美国Promega公司。
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的摄取及降解 。 1.3 细胞
中医将AD归属于“痴呆”范畴，认为痴呆病位在脑， 小鼠神经小胶质细胞BV2购自武汉普诺赛生命科技
多为本虚标实之证，以脏腑精气亏虚、脑失所养为本，痰 有限公司；人胚胎肾细胞HEK293购自中国科学院细胞库。
气交阻为标。脾主运化，脾失健运则气血亏虚，脑髓失 2 方法
养而生痴呆；脾喜燥恶湿，脾气亏虚则运化水液失常，水 2.1 EEAM的制备
湿停聚内生痰湿，痰蒙清窍亦生痴呆。脾虚痰湿是早期 参考本课题组前期制备方法 操作：称取白术饮片
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AD发生发展的病机之一，故健脾化痰为治疗AD的有效 2 kg，共加入95%乙醇4 L分别浸渍3次，每次1周；合并
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方法之一 。中药白术为菊科苍术属植物白术 Atracty‐ 滤液，减压浓缩得到 EEAM 浸膏 359 g，得率为 17.95%
lodes macrocephala Koidz. 的干燥根茎，被誉为“脾脏补 （以生药量计），置于4 ℃下保存，备用。
气健脾”第一要药。本课题组前期研究发现，白术乙醇 2.2 细胞培养
提取物（ethanol extract from Atractylodes macrocephala， 将BV2细胞以含有10%胎牛血清、1%青-链霉素混
EEAM）可延缓AD模型秀丽隐杆线虫CL4176的瘫痪时 合液的MEM完全培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养
间，调节溶酶体自噬，降解淀粉样蛋白前体蛋白，从而改 箱中培养，待细胞密度达到80%左右时，进行后续实验。
善AD [9―11] 。但是白术乙醇提取物是否可通过PPAR-γ信 将 HEK293 细胞以含有 10% 胎牛血清、1% 青-链霉素混
号通路促进小胶质细胞对Aβ的摄取及降解，尚不明确。 合液的 DMEM 完全培养基培养，然后同上述条件培养
基于此，本研究以小鼠小胶质细胞 BV2 为研究对象，从 后进行后续实验。
PPAR-γ 信号通路出发，探讨 EEAM 促进小胶质细胞对 2.3 EEAM对BV2细胞活力的影响
Aβ摄取及降解的作用机制，以期为EEAM治疗AD的临 采用MTT法对细胞活力进行测定。取对数生长期
床应用提供实验依据。 的BV2细胞接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为
1 材料 空白对照组和 EEAM 低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5
1.1 主要仪器 mg/mL，剂量参考前期预实验设置），每组设置6个复孔。
本研究所用主要仪器有Airtech型超净台（苏州安泰 各孔加入相应含药培养基培养 24 h 后，避光加入 5
空气技术有限公司），Forma Series Ⅱ Water Jacket 型二 mg/mL MTT 溶液 20 µL，继续培养 4 h；弃去培养基，每
氧化碳细胞培养箱、Multiskan GO 型全波长酶标仪（美 孔加入二甲基亚砜 150 μL，摇床振摇 10 min，采用酶标
国 Thermo Fisher Scientific 公司），Axiocam 506 Color 型 仪在490 nm处测定各孔光密度（optical density，OD）值，
显微镜、LSM700 型共聚焦荧光显微镜（德国 Carl Zeiss 并计算细胞存活率（细胞存活率＝给药组OD值/空白对
公司），FLUOstar OPTIMA 型多功能酶标仪（德国 BMG 照组OD值×100%）。
Labtech 公司），Roche LightCycler 96 型实时荧光定量聚 2.4 EEAM对BV2细胞摄取及降解Aβ的影响
合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司）。 采用共聚焦皿平行铺BV2细胞，分为摄取组及降解
1.2 主要药品与试剂 组，2 组细胞再分别设置空白对照组、阳性对照组（1
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白术饮片购自安徽亳州药材市场，经河南中医药大 μmo/L罗格列酮，剂量参考文献 及预实验结果设置，下
学药学院付钰副教授鉴定为菊科植物白术 A.macro‐ 同）和 EEAM 低、中、高剂量组（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每
cephala Koidz. 的干燥根茎。pCMX-Gal-mPPAR-γ 及 组设置3个复孔。培养过夜后，次日分别给予相应药物
PPRE-J3-TK-Luc 质粒由本实验室构建。兔源 PPAR-γ 处理24 h，每皿加入500 nmol/L FAM-Aβ（带有红色荧光
中国药房 2023年第34卷第1期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 1 · 13 ·
