Page 61 - 《中国药房》2022年23期
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病理切片。取部分切片再经二甲苯脱蜡、苏木素-伊红 表2 各组大鼠血清中血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗
染色、梯度乙醇脱水后，以中性树胶封片，于光学显微镜 指数检测结果（x±s，n＝10）
下观察各组大鼠卵巢组织的病理形态学变化并拍照。 组别 血糖/（mmol/L） 胰岛素/（mU/L） 胰岛素抵抗指数
2.6 大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK蛋白表达水平的检测 正常组 5.68±0.12 9.06±0.08 2.29±0.07
模型组 10.46±0.10 a 32.52±1.23 a 15.11±0.56 a
采用免疫组织化学法进行检测。取“2.5”项下制备 达英-35+二甲双胍组 6.21±0.09 b 9.81±0.13 b 2.70±0.06 b
的组织切片经脱蜡、水化后，H2O2封闭，清洗，柠檬酸盐 金匮肾气丸低剂量组 8.80±0.14 b 20.32±0.65 b 7.95±0.37 b
缓冲液热修复，滴加山羊血清封闭液，室温孵育；倾去液 金匮肾气丸中剂量组 7.53±0.05 b 16.62±0.96 b 5.56±0.34 b
金匮肾气丸高剂量组 6.70±0.13 b 12.97±0.88 b 3.86±0.24 b
体，分别滴加LKB1（稀释度为1∶2 000）、AMPK（稀释度
a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
为 1∶1 000）抗体，4 ℃孵育过夜；滴加二抗，37 ℃孵育
（P＜0.05），FSH水平均显著升高（P＜0.05）；达英-35+二
20 min，以DAB显色，经自来水冲洗后，再以苏木素复染
甲双胍组和金匮肾气丸中剂量组大鼠血清中 E2水平均
1～2 min；以盐酸乙醇进行分化，经自来水冲洗、脱水、透
显著升高（P＜0.05），T 水平均显著降低（P＜0.05）。结
明、封片后，于光学显微镜下观察。采用Image-Pro Plus 6.0
果见表3。
软件检测每个视野中阳性染色区域的积分光密度
表3 各组大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的检
（integrated optical density，IOD）值，IOD 值越大，表示蛋
测结果（x±s，n＝10）
白表达水平越高。
组别 E 2/（pmol/L） T/（nmol/L） GnRH/（mIU/mL） FSH/ （mIU/mL） LH/ （mIU/mL）
2.7 大鼠卵巢组织中 LKB1、AMPK mRNA 表达水平 正常组 45.24±13.58 1.15±0.18 35.09±3.77 63.63±12.10 54.81±2.73
的检测 模型组 24.44±9.35 a 1.70±0.21 a 49.66±6.12 a 22.38±3.52 a 65.67±10.52 a
达英-35+二甲双胍组 52.37±11.66 b 1.16±0.31 b 31.19±7.20 b 66.55±11.76 b 49.39±4.77 b
采用实时荧光定量PCR法进行检测。取“2.2”项下
金匮肾气丸低剂量组 33.26±15.78 1.44±0.40 30.62±4.61 b 59.96±3.01 b 56.46±7.35 b
各组大鼠卵巢组织适量进行匀浆，以 Trizol 试剂提取总 金匮肾气丸中剂量组 44.61±14.04 b 1.03±0.61 b 33.94±7.66 b 65.93±7.50 b 53.01±7.08 b
RNA，再经逆转录合成 cDNA。以 cDNA 为模板进行 金匮肾气丸高剂量组 31.76±11.01 1.50±0.47 38.19±8.24 b 64.67±9.44 b 51.35±6.86 b
PCR 扩增，分析各产物扩增曲线，以 GAPDH 为内参，采 a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
用2 －△△Ct 法计算目的基因mRNA的表达水平。PCR引物 3.3 大鼠卵巢系数的检测结果
序列及扩增产物长度见表1。 与正常组[（5.69±0.40）×10 ]比较，模型组大鼠卵
－4
－4
表1 PCR引物序列及扩增产物长度 巢系数[（6.36±0.67）×10 ]显著增加（P＜0.05）；与模型
基因名称 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp 组比较，达英-35+二甲双胍组和金匮肾气丸各剂量组大
LKB1 上游引物：GCCTTGCACCCTTTCGCT 248 鼠卵巢系数[分别为（4.51±0.52）×10 、（5.55±0.45）×
－4
下游引物：AGTGGTGGAGCGCAGTCA 10 、（4.69±0.72）×10 、（5.03±0.45）×10 ]均显著降
－4
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AMPK 上游引物：CACTGGATGCACTCAACACAAC 153
下游引物：TCACTACCTTCCATTCAAAGTCC 低（P＜0.05）。
GAPDH 上游引物：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG 138 3.4 大鼠卵巢组织病理形态学的观察结果
下游引物：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
正常组大鼠卵巢组织结构完整，各级卵泡数量较
2.8 统计学方法 多、发育良好，存在正常的黄体和白体；模型组大鼠卵巢
数据采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料 皮质胶原化，闭锁卵泡及无卵丘的囊性卵泡数量增多，
均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差 卵泡颗粒细胞层厚度减小，可见卵泡囊性病变；达英-35+
齐者组间两两比较采用 LSD-t 检验，方差不齐者采用 二甲双胍组大鼠卵巢组织结构基本完整，各级卵泡形态
Dunnett’s t检验。检验水准α＝0.05。 完好，未见卵泡囊性改变，卵泡颗粒细胞层厚度增加，存
3 结果 在少量黄体和白体；金匮肾气丸低剂量组大鼠卵巢组织
3.1 大鼠血清中血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的 中可见较多的闭锁卵泡和无卵丘囊性卵泡，卵泡颗粒细
检测结果 胞层厚度减小；金匮肾气丸中、高剂量组大鼠卵巢组织
与正常组比较，模型组大鼠血糖、胰岛素水平及胰 内各级卵泡数量增多，卵泡颗粒细胞层厚度增加，放射
岛素抵抗指数均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，达 冠清晰，存在少量黄体和白体，未见卵泡囊性病变。结
英-35+二甲双胍组和金匮肾气丸各剂量组大鼠上述指 果见图1。
标水平均显著降低（P＜0.05）。结果见表2。 3.5 大鼠卵巢组织中LKB1、AMPK蛋白表达水平的检
3.2 大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的检测结果 测结果
与正常组比较，模型组大鼠血清中 T、GnRH 和 LH 正常组大鼠卵巢组织中有大量 LKB1、AMPK 蛋白
水平均显著升高（P＜0.05），E2和 FSH 水平均显著降低 表达。与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织中有少量
（P＜0.05）；与模型组比较，达英-35+二甲双胍组和金匮 LKB1、AMPK蛋白表达，其阳性表达IOD值均显著降低
肾气丸各剂量组大鼠血清中GnRH、LH水平均显著降低 （P＜0.05）；与模型组比较，达英-35+二甲双胍组和金匮
中国药房 2022年第33卷第23期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 23 · 2871 ·
