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2.5 大鼠心肌组织中ROS水平检测                                  2.9 统计学方法
              取冻存的大鼠心肌组织约 50 mg，于 300 目尼龙网                        采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析。计量资料以
          上研磨制成组织匀浆，以 1 000 r/min 离心 5 min 制备细                x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          胞悬液，加入 2 mL DCFH-DA 探针，在 37 ℃孵育 30                  比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          min，然后再以1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀物。                 3 结果
          使用多功能微孔板读数仪在激发波长504 nm、发射波长                         3.1 滇乌碱对大鼠血清中心肌酶学指标的影响
          529 nm 处检测 ROS 的荧光强度，荧光强度越高表示                           与正常组比较，滇乌碱高、低剂量组和乌头碱组大
          ROS水平越高。                                            鼠血清中 LDH、CK、CK-MB 水平均显著升高（P＜0.05
          2.6 大鼠心肌组织病理形态学及线粒体超微结构观察                           或P＜0.01），详见表1。
              取 4% 多聚甲醛固定的心肌组织（每组随机选 3 只                      表1 各组大鼠血清中 LDH、CK、CK-MB 水平检测结
          大鼠样本），经过脱水浸蜡、石蜡包埋、切片（厚度4 μm）、                            果（x±s，n＝10，U/L）
          HE染色后，用中性树脂封片，于光学显微镜下观察心肌                           组别              LDH         CK         CK-MB
                                                              正常组           568.80±141.75  636.30±135.30  139.50±73.12
          组织病理学变化。另取 2.5% 戊二醛固定的心肌组织                          滇乌碱高剂量组       781.70±158.26 a  1 149.00±228.51 a  226.04±76.29 a
                  3
         （约1 mm 的小块），经过常规的脱水、树脂渗透、烘烤、包                        滇乌碱低剂量组       739.80±182.25 b  1 118.40±286.17 a  212.50±64.67 b
          埋、加热聚合固化、切片（厚度1 μm）、铀铅双染色、2%乙                       乌头碱组          782.30±151.09 a  1 063.40±173.07 a  222.00±60.20 b
                                                                 a：与正常组比较，P＜0.01；b：与正常组比较，P＜0.05
          酸双氧铀染色、檬酸铅染色后，于电子透射显微镜下观
          察心肌组织线粒体变化。                                         3.2 滇乌碱对大鼠血清中 MDA 含量和 SOD 活性的
                                                              影响
          2.7 大鼠心肌细胞凋亡检测
                                                                  与正常组比较，滇乌碱高、低剂量组和乌头碱组大
              取“2.6”项下的心肌组织石蜡切片（厚度 4 μm），脱
                                                              鼠血清中 MDA 含量均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），
          蜡水合后，使用磷酸盐缓冲液（PBS）、蛋白酶K及封闭液
                                                              SOD活性均显著降低（P＜0.01），详见表2。
          预处理切片。用TdT酶反应液覆盖切片，在避光条件下
                                                              表2 各组大鼠血清中MDA含量和SOD活性检测结果
          以37 ℃培养60 min，再将荧光素抗体（稀释比例1∶200）
                                                                  （x±s，n＝10）
          覆盖切片，避光培养30 min；PBS冲洗切片后，在荧光显
                                                              组别                MDA含量/（nmol/mL）   SOD活性/（U/mL）
          微镜下观察心肌细胞凋亡情况并拍照记录，每个样本选
                                                              正常组                  0.40±0.05        11.05±0.40
          取 3 个视野，使用 Image J V 1.8.0 软件对视野内凋亡细                滇乌碱高剂量组              0.49±0.04 a      10.32±0.24 a
          胞进行计数，取平均值。                                         滇乌碱低剂量组              0.46±0.04 b      10.43±0.31 a
                                                              乌头碱组                 0.50±0.09 a      10.41±0.30 a
          2.8 大鼠心肌组织中线粒体途径凋亡相关蛋白表达
                                                                 a：与正常组比较，P＜0.01；b：与正常组比较，P＜0.05
          检测
                                                              3.3 滇乌碱对大鼠心肌组织中ROS水平的影响
              每组随机选取3只大鼠的组织样本进行实验。称取
                                                                  与正常组[ROS 荧光强度为 5.61±0.34（n＝10）]比
          冻存的大鼠心肌组织约1 000 mg，剪碎后加入适量裂解
                                                              较，滇乌碱高、低剂量组和乌头碱组大鼠心肌组织中
          液提取总蛋白，并使用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒测定
                                                              ROS水平[ROS荧光强度依次为7.57±0.81、7.38±0.97、
          总蛋白浓度。将提取的总蛋白配制成上样缓冲液后煮
                                                              8.71±1.17（n＝10）]均显著升高（P＜0.01）。
          沸，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶
                                                              3.4 滇乌碱对大鼠心肌组织病理形态学及线粒体超微
          电压60～100 V，时间为30 min；分离胶电压100～200 V，
                                                              结构的影响
          时间为 60 min ）分离蛋白，将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜
                                                              3.4.1 心肌组织病理形态学 光镜下，正常组大鼠心肌
         （Bax、Bcl-2 的电转条件为 300 mA、30 min，caspase-3、           组织细胞排列紧凑、规整，心肌细胞形态及细胞核无异
          caspase-9 的电转条件为 300 mA、45 min）；用 5% 脱脂奶            常变化。与正常组比较，各给药组大鼠心肌细胞排列不
          粉封闭过夜，次日加入 Bax 一抗（稀释比例为 1∶2 000）、                   紧凑，胞间空隙增大，心肌细胞的胞质出现明显空泡，部
          Bcl-2一抗（稀释比例为1∶500）、caspase-3一抗（稀释比例                分细胞核固缩，少量心肌纤维出现断裂，其中以滇乌碱
          为1∶500）、caspase-9一抗（稀释比例为1∶1 000）、GAPDH 一           高剂量组大鼠的病变程度最高。结果见图1。
          抗（稀释比例为 1∶10 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入                    3.4.2 心肌组织线粒体超微结构 电镜下，正常组大鼠
          相应二抗（稀释比例为 1∶40 000），室温孵育 2 h；用 ECL                 心肌组织线粒体超微结构无明显变化，线粒体嵴丰富，
          显色试剂盒显色，化学发光成像仪下显影并拍照，使用                            未见明显肿胀。滇乌碱高、低剂量组大鼠心肌组织线粒
          Image JV 1.8.0 软件分析条带灰度值。以目标蛋白条带                    体大小不等、分布紊乱，少数线粒体明显肿胀、空泡化、
          灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示各目                           嵴断裂、嵴减少，可见圆盘状嵴线粒体，少数线粒体体积
          标蛋白的相对表达水平。                                         缩小、内嵴扩张，偶见线粒体自噬。乌头碱组大鼠心肌


          · 2866 ·    China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 23                            中国药房  2022年第33卷第23期
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