Page 49 - 《中国药房》2022年20期

2.5 紫花地丁总香豆素纯化物抗肿瘤活性的评价
[13]
2.5.1 细胞存活率 参考相关文献的方法 ，取对数生
长期的 HeLa、HCCC-9810、HepG2、MDA-MB-231、A549
细胞，分别用胰蛋白酶消化，离心后调整细胞密度为1×
5
10 个/mL，按每孔 0.1 mL 接种于 96 孔板中，于 37 ℃、
5%CO2条件下培养 24 h，吸出原培养基，每孔加入含药
培养基（参考预实验结果，将紫花地丁总香豆素纯化物
的质量浓度分别设置为 20、60、100、140、180、220、260、 A.对照组 B. 20 μg/mL紫花地丁总香豆素纯化物组
300 μg/mL）100 μL（每质量浓度设置3个复孔），同时设
置空白孔（只含培养基）和对照孔（含细胞和培养基）。
常规培养 24 h，加入 CCK-8 试剂 10 μL，继续培养 45
min，使用酶标仪于450 nm处测定各孔的光密度（OD）并
按下式计算细胞存活率：细胞存活率＝（OD1－OD0 ）/
（OD2－OD0 ）×100%（式中，OD0、OD1、OD2分别为空白
孔、含药孔、对照孔的OD）。结果显示，紫花地丁总香豆
C. 60 μg/mL紫花地丁总香豆素纯化物组 D. 180 μg/mL紫花地丁总香豆素纯化物组
素纯化物对上述5种肿瘤细胞均有一定的抑制作用，其 图4 紫花地丁总香豆素纯化物对 HCCC-9810 细胞凋
IC50 分别为（113.18±15.97）、（51.17±1.72）、（134.15± 亡影响的荧光显微图（Hoechst 33258染色，×200）
11.75）、（171.83±15.27）、（93.38±4.65）μg/mL。
1 000 a a 40
2.5.2 细胞凋亡形态 由“2.5.1”项下结果可知，紫花地 800 a 30 b a
丁总香豆素纯化物对 HCCC-9810 细胞的抑制作用相对 （ nmol/mL ） 600 （ nmol/mL ） a

较强，因此选取对数生长期的 HCCC-9810 细胞，按 400 SOD/ 20
“2.5.1”项下方法配制细胞悬液并接种于 6 孔板中，培养 LDH/ 200 10
过夜，在参考预实验结果的基础上，以 0（对照组）、20、 0 0
0 20 60 180 0 20 60 180
60、180 μg/mL的紫花地丁总香豆素纯化物（每组设置3 紫花地丁总香豆素纯化物/（μg/mL） 紫花地丁总香豆素纯化物/（μg/mL）
A. LDH B. SOD
个复孔）作用24 h后，吸出培养基，细胞用磷酸盐缓冲液
a：与对照组比较，P＜0.01；b：与对照组比较，P＜0.05
清洗 2 次，以 Hoechst 33258 试剂染色后，置于倒置相差 图5 紫花地丁总香豆素纯化物对 HCCC-9810 细胞中
显微镜和荧光倒置显微镜下观察细胞的凋亡形态并拍 LDH和SOD含量的影响（x±s，n＝3）
照。结果（图4）显示，对照组细胞呈近椭圆形，染色后呈
3 结论
蓝色且均匀、浅淡；随紫花地丁总香豆素纯化物浓度的
本研究采用单因素实验和响应面实验对紫花地丁
增加，含药组细胞数量逐渐减少，细胞核开始出现明显 总香豆素的提取工艺进行了优化，得最优提取工艺为液
的固缩或分裂，多数细胞核呈现出较强的蓝白色碎块状 料比 25∶1，提取时间 1.9 h，乙醇体积分数 68%。验证实
荧光，即典型的凋亡细胞核特征。 验显示，该工艺稳定、可行。
2.5.3 肿瘤细胞中 LDH、SOD 含量 按“2.5.2”项下接 DPPH 和 ABTS 为氮自由基，DPPH 自由基及 ABTS
种、培养HCCC-9810细胞，待作用24 h后，吸出培养基， 自由基清除法被广泛用于中药提取物体外抗氧化活性
[14]
细胞用磷酸盐缓冲液清洗2次，消化，以1 000 r/min离心 研究领域 。在此基础上，本研究还选择了PTIO自由基
5 min，超声（功率180 W，频率40 kHz）后收集于2 mL离 清除法考察体外抗氧化活性。PTIO是一种常用的一氧
[12]
化氮清除剂，其带电基团为氧原子 。本研究结果显示，
心管内，使用酶标仪检测各组细胞中LDH、SOD含量，严
紫花地丁总香豆素纯化物对DPPH、ABTS自由基的清除
格按照各试剂盒说明书操作。采用SPSS 17.0软件进行
能力略弱于抗坏血酸，但对 PTIO 自由基的清除能力较
统计分析并使用GraphPad Prism 8软件绘图，数据以x±s
弱，这可能是由于 PTIO 自由基清除法主要用于水相体
表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较
系，而紫花地丁总香豆素水溶性较低，故其清除效果
采用 LSD-t 检验，检验水准 α＝0.05。结果（图 5）显示， 不佳。
20、60、180 μg/mL的紫花地丁总香豆素纯化物可显著增 抗肿瘤活性研究显示，紫花地丁总香豆素纯化物对
加 HCCC-9810 细胞中 LDH 含量，并可显著降低细胞中 HeLa、HCCC-9810、HepG2、MDA-MB-231、A549 细胞均
SOD含量（P＜0.05或P＜0.01）。 有一定的抑制作用，其中对 HCCC-9810 细胞的抑制效

中国药房 2022年第33卷第20期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20 ·2475·