Page 18 - 《中国药房》2022年20期
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功效，常用于瘰疬、痈肿、跌打损伤、急性扁桃体炎、慢性                          马鱼饲养中心的养殖房[光照 14 h、黑暗 10 h 交替，水温
          支气管炎、乳腺癌、恶性淋巴癌、肺癌等疾病的临床治                           （28.0±0.5）℃，水pH6.8～7.5，室温26 ℃]内。
          疗 [1―5] 。现代研究发现，了哥王具有抗肿瘤、镇痛、抗菌、                     2 方法
          抗炎、镇咳袪痰等药理作用            [6―7] 。该药疗效确切，临床应           2.1 斑马鱼胚胎培养液的配制
          用价值和市场潜力较大，但因毒性作用较强，使得其进                                按照 The Zebrafish Book 标准配制斑马鱼胚胎培养
          一步开发和利用受限。《生草药性备要》《湖南药物志》中                          液，其中 NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4、
          均有了哥王“大毒”或“有毒”的毒性记载                 [8―9] 。目前，国     NaHCO3的浓度分别为 0.14、5.40、0.25、0.44、1.30、1.00、
          内外有关了哥王的毒性研究大多基于大鼠和小鼠模                              4.20 mol/L。
          型 [10―12] ，具有成本高、周期长、不便于观察等缺点。斑马                    2.2 了哥王提取物的制备
          鱼作为一种新的模式生物，其幼鱼及胚胎通体透明，且                                参照课题组前期研究方法制备了哥王提取物并进
          繁殖率高、生长发育周期短，加之其与人类基因的相似                            行相关分析：取了哥王药材粗粉 5 kg，以 14 倍量的 70%
          度高达87%，故在筛选和评价药物毒性方面具有独特优                           乙醇按 5 mL/（min·kg）的速度进行渗漉提取；收集渗漉
            [13]
          势 。基于此，本文拟利用斑马鱼模型，探讨了哥王提                            提取液，回收乙醇至提取液无醇味，采用低压真空浓缩
          取物对斑马鱼胚胎、斑马鱼的毒性作用，以期为其毒性                            干燥法（温度 60 ℃，真空度 0.07～0.08 MPa）进行浓缩、
          的深入研究提供实验参考。                                        干燥后，粉碎成细粉，得了哥王提取物粉末（伞形花内酯
          1 材料                                                和西瑞香素的含量分别为 0.067、2.263 mg/g，浸膏得率
                                                                                                        [14]
          1.1 主要仪器                                            为10.08%，每1 g了哥王提取物相当于生药9.92 g） 。
              本研究所用主要仪器有MULTISKAN SKY 1530型                   2.3 了哥王提取物药液的配制
          全自动酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]、                                精密称取“2.2”项下了哥王提取物粉末适量，溶于一
          SMZ18型体视荧光显微镜（日本Nikon公司）、CKX53型                     定量的 DMSO 中，涡旋溶解后，再加入胚胎培养液配制
          倒置相差显微镜（上海蛮吉光电科技有限公司）、PCO-                          成1 mg/mL的母液，于实验前加胚胎培养液稀释至所需
          1500型立体显微镜及成像系统（武汉鑫力钧生物科技有                          浓度。
          限公司）、ESENAWS1型斑马鱼养殖系统（北京爱生科技                        2.4  了哥王提取物对斑马鱼胚胎发育的影响
          发展有限公司）、SLI700型生化培养箱（天津信睿生物科                            于实验前一天晚上，将健康成年的斑马鱼按雌雄比
          技有限公司）等。                                            例1∶1放入产卵缸中，使其自然受精产卵。随机选取受
          1.2  主要药品与试剂                                        精后 6～8 h（6-8 hours post fertilization，6～8 hpf）、发育
              了哥王药材购自广西壮族自治区玉林市玉州区玉                           正常且无畸形的斑马鱼胚胎，转移至12孔细胞培养板中
          林银丰国际中药港，经贵州中医药大学药学院李玮教授                           （每孔 20 枚胚胎），并加入适量胚胎培养液培养 24 h，培
          鉴定为瑞香科荛花属植物了哥王 W. indica（Linn.）C.A.                 养温度为（28.0±0.5）℃。
          Mey.的干燥根或根皮。                                        2.4.1  药物暴露质量浓度的选取与药液的配制                   设置
              吖啶橙（批号325E043）、油红O染液（批号20190910）、               暴露质量浓度为10、20、40 μg/mL（质量浓度参考课题组
          PBS（批号20190517）、DMSO（批号821D0311）均购自北                前期预实验结果设置），并按照“2.3”项下方法配制质量
          京索莱宝科技有限公司；4% 多聚甲醛（批号 190620）购                      浓度分别为10、20、40 μg/mL的了哥王提取物药液。
          自上海尚宝生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（lactate de‐                     2.4.2  暴露处理     设置了哥王提取物 10、20、40 μg/mL
          hydrogenase，LDH）、天冬氨酸转氨酶（aspartate amino‐           组和空白组（每孔 20 枚胚胎，每组设置 2 个复孔），缓慢
          transferase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransfe-       吸出各孔中的胚胎培养液，各药物组分别按 4 mL/孔加
          rase，ALT）检测试剂盒（批号均为20191118）均购自南京                   入“2.4.1”项下不同质量浓度的了哥王提取物药液进行
          建成生物工程研究所；NaCl、KCl、K2HPO4、Na2HPO4、                  暴露，空白组加入等体积的胚胎培养液和等量的DMSO
          NaHCO3、MgSO4、CaCl2 等 试 剂 均 为 分 析 纯 ，水 为 纯           作为对照。加盖标记后，将培养板置于生化培养箱中孵
          净水。                                                 育72 h，每24 h更换药液1次。
          1.3 实验动物                                            2.4.3  斑马鱼胚胎自主抽动次数、心率及其畸形率、死
              AB系野生型斑马鱼，雌雄各半，购自国家斑马鱼资                         亡率的测定       暴露24 h后，使用立体显微镜及成像系统
          源中心，4～6 月龄（繁育、培养方法参照 The Zebrafish                  观察各组斑马鱼 1 min 内的胚胎自主抽动次数（每组选
          Book），其相关质量控制项（微生物学等级及监测、寄生                         取10枚胚胎）；暴露48 h后，使用立体显微镜及成像系统
          虫学等级及监测、遗传质量控制、病理诊断、配合饲料、                           观察各组斑马鱼 10 s 内的胚胎心率（每组选取 10 枚胚
          环境条件）均符合北京市实验用鱼质量控制地方标准。                            胎）；暴露72 h后，计算各组斑马鱼胚胎的畸形率和死亡
          所有斑马鱼均饲养于贵州中医药大学第一附属医院斑                             率：畸形率（%）＝某一时间点幼鱼的畸形数/某一时间点


          ·2444·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20                                 中国药房    2022年第33卷第20期
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