Page 41 - 《中国药房》2022年15期
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2 方法                                               12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA试剂盒测
        2.1 分组、造模与给药                                       定蛋白浓度。将上清液加入适量蛋白上样缓冲液煮沸
            将60只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性                       15 min后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳，转膜；
        药对照组、QJHGD治疗组，每组15只。造模前24 h大鼠                      以脱脂奶粉封闭2 h，加入HMGB1、Occludin、ZO-1一抗
                                                   [10]
        禁食不禁水，采用雨蛙素联合脂多糖腹腔注射法 ，并                           （稀释度均为1∶1 000）和GAPDH一抗（稀释度为1∶3 000），
                                   [11]
        参考《药理实验方法学（第4版）》 造模。模型组、阳性药                        4 ℃孵育过夜；以 TBST 洗涤重复 3 次，每次 5 min，加入
        对照组、QJHGD治疗组大鼠腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），                   二抗（稀释度为 1 ∶ 5 000），常温孵育 1 h；以 ECL 发光液
        每小时 1 次，连续 6 次，第 7 次注射脂多糖（10 mg/kg）以               显影曝光，并用凝胶成像系统成像。采用 Image J 软件
        复制 SAP 模型。末次注射后，各组取 3 只大鼠，剖取大                      进行条带定量分析，以目的蛋白与内参的灰度值比值表
        鼠胰腺组织，当胰腺发生水肿渗出、局部呈暗红色且被                           示其表达水平。
                                  [12]
        膜下有出血点时，表明造模成功 。造模成功后，QJHGD                        2.3 肠道菌群分析
        治疗组大鼠灌胃 QJHGD 药液（7 g/kg，剂量根据临床等                    2.3.1  肠道菌群16S rRNA测序         取“2.2.3”项下各组大
        效剂量换算而得），阳性药对照组大鼠腹腔注射乌司他                           鼠的小肠内容物至对应编号的无菌冻存管中，置于
        丁（5 U/kg，剂量根据临床等效剂量换算而得），空白对照                      －80 ℃冰箱冻存后，送至上海中科新生命生物科技有限
        组、模型组大鼠灌胃与 QJHGD 治疗组腹腔注射等体积                        公司进行16S rRNA高通量测序。由于取材时阳性药对
        的生理盐水，每天2次，连续3 d。                                  照组大鼠小肠内容物污染严重，故未进行测序。
        2.2 生存状态观察及指标检测                                    2.3.2  肠道菌群多样性分析           将“2.3.1”项下测序得到
        2.2.1  大鼠生存状态的观察           观察并记录各组大鼠造              的原始数据用 FLASH 软件进行序列拼接、过滤及去嵌
        模及给药后的精神状态、呼吸、活动、饮食、腹部膨胀情                          合体，得到有效数据。基于有效数据进行分类操作单元
        况等方面的变化，统计大鼠3 d内的死亡情况，然后从各                         聚类（operational taxonomic units，OTUs）和物种分类：采
        组剩余大鼠中分别抽取10只进行后续实验。                               用 UPARSE 软件包结合 UPARSE-otu 和 UPARSE-oturef
        2.2.2  大鼠血清中血清淀粉酶及炎症因子水平的检                         算法分析α多样性（样本内）和β多样性（样本间），将相似
        测   大鼠末次给药后1 h，腹主动脉取血约5 mL，室温静                     性≥97％的序列归为相同OTUs；采用Shannon、Simpson、
        置 2 h，以 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液分装于试管            Ace、Coverage、Chao1 指数表征菌群多样性。对 OTUs
        中，采用全自动生化检测仪检测大鼠血清中血清淀粉酶                           多样性指数进行分析，并基于Bray-Curtis算法对微生物
        水平，采用 ELISA 法检测大鼠血清中 IL10、IL-18、IL-1β              结构组间差异进行分析。
        水平。                                                2.4  统计学方法
        2.2.3  大鼠胰腺及小肠组织的病理学观察                 采用苏木            实验数据采用SPSS 25.0软件统计分析，计量资料以
        素-伊红染色法进行观察。各组大鼠取血完成后，腹腔                           x±s 表示。对符合正态分布和方差齐性的数据采用单
        注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，处死。取大鼠胰                      因素方差分析，各组间两两比较采用LSD-t检验；对不符
        头组织及距回盲部2 cm左右的小肠组织（并收集其小肠                         合正态分布和方差齐性的数据采用秩和检验。检验水
        内容物，备用），部分固定于4％多聚甲醛溶液中（另外部                         准α＝0.05。基于 Bray-Curtis 算法对微生物结构组间差
        分用无酶、无菌管收集后于－80 ℃冰箱中保存），再进行                        异 进 行 Anosim 非 参 数 检 验 。 本 研 究 采 用 Graphpad
        梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度 4                          Prism8软件进行绘图。
        µm）。切片以苏木素染色5 min，依次洗涤、分化后，再以                      3 结果
        伊红染色30 s，然后进行脱水、透明，用中性树胶密封，置                       3.1 QJHGD对SAP模型大鼠生存状态的影响
        于显微镜下观察胰腺及小肠组织的病理变化。采用                                 空白对照组大鼠精神较佳，饮食规律，活动自如；模
                                      [13]
        Schmidt 法进行胰腺组织病理评分 ，采用 Chiu 等 报                   型组大鼠造模后状态较差，出现精神萎靡、呼吸急促、嗜
                                                    [14]
        告的标准化评分方法进行小肠组织病理评分。病理切                            睡、食欲差、蜷缩颤抖、腹部膨胀等症状；阳性药对照组
        片由广西中医药大学第一附属医院和广西医科大学附                            和 QJHGD 治疗组较模型组大鼠腹部膨胀症状明显减
        属肿瘤医院病理科2位主任医师进行双盲观察，综合两                           轻，饮食及活动增加，精神状态恢复较好。空白对照组
        者意见得到最终评分。                                         大鼠无死亡现象；模型组大鼠造模 24 h 后开始死亡，造
        2.2.4  大鼠小肠组织中HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表               模后共死亡 6 只大鼠（模型组最后死亡的 1 只大鼠在造
        达水平的检测        取“2.2.3”项下保存于－80 ℃冰箱的小               模后第3天，为保证后续实验各组大鼠数量一致、基线可
        肠组织适量，加入600 μL RIPA裂解液研磨，于4 ℃下以                    比，笔者在其濒临死亡时，立即麻醉取材）；阳性药对照


        中国药房    2022年第33卷第15期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 15  ·1827 ·
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