Page 36 - 《中国药房》2022年15期
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流式细胞仪验证其纯度为96％～98％ 。本研究临床血                          培养 24 h 后，按“2.3”项下方法加药处理。处理 48 h 后，
                                         [9]
        液样本的获取符合相关临床试验研究法规、规范及《赫                            收集细胞，按照 RNA 抽提试剂盒步骤提取细胞中总
        尔辛基宣言》要求，并经南阳市中心医院医学伦理委员                            RNA，并测定总RNA的浓度。取1 μg总RNA反转录合
        会审查、批准后实施（伦理批件号为2017-11-10-01）。                     成 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。反应体系
        1.5 质粒                                             （20 μL）如下：cDNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）
            pGL3-Basic-luc载体质粒（批号E1751）、海肾荧光素               各 0.5 μL，SYBR Green 试剂 10 μL，超纯水 8 μL。反应
        酶RL-TK质粒（批号E2241）均购自美国Promega公司。                    条件如下：95 ℃热启动 15 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火
        2 方法                                                30 s，72 ℃延伸 30 s ，共 40 个循环。以 GAPDH 作为内
        2.1 温阳化浊通络方水煎液的制备                                   参，采用 2   －ΔΔCt 法计算各目的基因 mRNA 的表达水平。
            按温阳化浊通络方组成称取相应量饮片，加10倍量                         引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，
        水（mL/g，下同）浸泡 1 h，武火煎煮开以后文火煎 30                      引物序列及扩增产物长度见表1。
        min，收集药液；药渣再加 10 倍量水以文火煎 30 min，收                             表1 引物序列及产物扩增长度
        集药液。合并 2 次煎煮液，浓缩得到生药量为 1.5 g/mL                     引物名称          引物序列（5′→3′）             扩增产物长度，bp
        的水提物（得率为 43.44％）。经高分辨质谱法测定，其                        qRT-PCR引物
        中主要含淫羊藿苷（0.98％）、积雪草苷（0.20％）、芥子碱                       RORγt       上游：CTGCTGAGAAGGACAGGGAG    204
                                                                          下游：AGTTCTGCTGACGGGTGC
        （0.07％）、黄芪甲苷（0.01％）等成分。
                                                              IL-17       上游：ACCAATCCCAAAAGGTCCTC    171
        2.2 动物分组、给药及含药血清的制备                                               下游：GGGGACAGAGTTCATGTGGT
            将 60 只大鼠随机分为空白对照组和温阳化浊通络                          GAPDH       上游：AACGGATTTGGTCGTATTG     208
                                                                          下游：GGAAGATGGTGATGGGATT
        方低、中、高剂量组，每组15只。温阳化浊通络方低、中、
                                                            甲基化特异性PCR引物
        高剂量组大鼠分别按照15、30、60 g/（kg·d）[分别为成人                     RORγt-启动子 M  上游：GTTGTTTAGGTTGGAGTGCG   175
        临床等效剂量的 1、2、4 倍，按照成人临床日用剂量（141                                    下游：CTAACTAACACGATAAAACCCCGT
                                                              RORγt-启动子 U  上游：GTTTAGGTTGGAGTGTGGTG   175
        g/d）及大鼠与成人体质量剂量折算系数（6.25）计算出大
                                                                          下游：CCTAACTAACACAATAAAACCCCAT
        鼠的日用药量为15 g/kg（141 g/60 kg×6.25≈15 g/kg）]灌
                                                            2.5  Western blot法检测细胞中RORγt蛋白表达水平
        胃给药，空白对照组大鼠灌胃等体积生理盐水。早晚各
                                                                将 Th17 细胞按每孔 1 mL（2×10 个细胞）接种到 12
                                                                                           5
        给药1次，连续灌胃7 d。各组大鼠分别于末次灌胃给药
                                                            孔板中，细胞分组及给药处理方法同“2.3”项下。处理
        30 min 后，在麻醉状态下于股动脉采血，将各组大鼠的
                                                            48 h 后，在 4 ℃ 下以 2 000 r/min 离心 5 min，收集细胞。
        血样混合后在 4 ℃下静置 2 h，再以 3 000 r/min 离心 10
                                                            使用 RIPA 裂解液提取细胞中总蛋白，以 BCA 法测定总
        min，吸取上清液，即得空白血清和含药血清。将血清用
                                                            蛋白的浓度，加入上样缓冲液将总蛋白煮沸 10 min 变
        0.45 μm滤器过滤除菌，分装后置于－80 ℃冰箱中保存，
                                                            性。配制10％聚丙烯酰胺凝胶，取40 μg总蛋白上样，先
        备用。
                                                            在 80 V 电压下电泳 30 min，待样品进入分离胶后，在
        2.3  CCK-8法检测Th17细胞增殖
                                                            120 V电压下电泳1 h；在200 mA电流下转移1 h至聚偏
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            将 Th17 细胞按每孔 100 μL（2×10 个细胞）接种到
                                                            二氟乙烯膜上，以 5％牛血清白蛋白在室温下封闭 1 h；
        96 孔板中，分为空白血清对照组，温阳化浊通络方含药
        血清低、中、高剂量组（后文简称含药血清低、中、高剂量                          分别加入RORγt一抗（稀释比例为1 ∶ 2 000）、GAPDH一
        组）和DAC组（阳性对照组），每组设置6个复孔；并另外                         抗（稀释比例为 1 ∶ 5 000），4 ℃孵育过夜；TBST 漂洗 5
        设置空白孔（加 100 μL 无细胞培养基）。常规培养 24 h                    min×5次，分别加入对应二抗（稀释比例均为1∶10 000），
        后，空白血清对照组加入 10％体积空白对照血清，含药                          室温孵育1.5 h；TBST漂洗5 min×5次，ECL化学发光试
        血清低、中、高剂量组分别加入10％体积对应含药血清，                          剂显色并用凝胶成像分析系统拍照。使用Image J 1.52 a
        DAC 组加入 1 μmol/L DAC 和 10％体积空白血清，处理                 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内
        48 h。每孔加入 10％体积 CCK-8 溶液，于 37 ℃下孵育                  参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示RORγt蛋白的表
        2 h。采用酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度（A），                      达水平。实验重复3次。
        计算细胞增殖率：细胞增殖率（％）＝（A 给药组－A 空白孔）/                     2.6 ELISA法检测细胞上清液中IL-17蛋白表达水平
                                                                                           5
        （A 空白对照组－A 空白孔 ）。实验重复3次。                                将 Th17 细胞按每孔 1 mL（2×10 个细胞）接种到 12
        2.4  qRT-PCR 法检测细胞中 RORγt、IL-17 mRNA 的              孔板中，细胞分组及给药处理方法同“2.3”项下。处理
        表达水平                                                48 h 后，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 min，收集细胞
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            将 Th17 细胞按每孔 500 μL（1×10 个细胞）接种到                上清液。按照 ELISA 试剂盒说明书操作步骤检测各组
        24 孔板中，分组同“2.3”项下，每组设置 3 个复孔。常规                     细胞上清液中IL-17蛋白表达水平。


        ·1822 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 15                                 中国药房    2022年第33卷第15期
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