Page 37 - 《中国药房》2022年15期
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2.7  甲基化特异性PCR法检测细胞中RORγt基因启动                      3.2  含药血清对细胞中 RORγt、IL-17 mRNA 表达的
        子甲基化水平                                             影响
            将 Th17 细胞按每孔 1 mL（2×10 个细胞）接种于 12                  与空白血清对照组比较，含药血清各剂量组和DAC
                                       5
        孔板中，细胞分组、给药处理方法同“2.3”项下。处理                         组细胞中RORγt mRNA表达水平以及含药血清中、高剂
        48 h后，收集细胞，采用柱式法提取细胞中总DNA，根据                       量组和 DAC 组细胞中 IL-17 mRNA 表达水平均显著降
        DNA甲基化修饰试剂盒方法进行DNA重亚硫酸盐处理                          低（P＜0.05）。结果见表2。
        将非甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），甲基化的                         表 2   各组细胞（上清液）中 RORγt、IL-17 mRNA 及其
        胞嘧啶（C）保持不变，回收并纯化DNA。使用在线工具                               蛋白表达水平的测定结果（x±±s，n＝3）
        MethPrimer 2.0（http：//www.urogene.org）设计RORγt基因                      RORγt               IL-17
                                                            组别
        启动子区甲基化（methylated，M）与非甲基化（methylated，                           mRNA     蛋白        mRNA   蛋白/（pg/mL）
                                                            空白血清对照组    1.050±0.099  1.645±0.035  1.000±0.156  80.730±2.113
        U）引物，甲基化特异性 PCR 引物由生工生物工程（上                         含药血清低剂量组   0.778±0.058 a  1.151±0.042 a  0.915±0.035  73.380±2.304 a
        海）股份有限公司合成（引物序列及扩增产物长度见表                            含药血清中剂量组   0.584±0.061 a  0.953±0.017 a  0.742±0.062 a  64.270±3.415 a
        1）。使用热启动DNA聚合酶进行甲基化特异性PCR反                          含药血清高剂量组   0.355±0.054 a  0.652±0.063 a  0.672±0.080 a  57.190±2.119 a
                                                            DAC组       0.244±0.040 a  0.151±0.041 a  0.464±0.039 a  55.120±4.334 a
        应，反应体系如下：DNA模板5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1
                                                               a：与空白血清对照组比较，P＜0.05
        μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，热启动DNA 聚合
                                                           3.3  含药血清对细胞（上清液）中RORγt、IL-17蛋白表
        酶 0.25 μL，反应缓冲液 10 μL，用水补至总体积 50 μL。
                                                           达的影响
        反应条件如下：95 ℃热启动30 s；95 ℃变性15 s，58 ℃退
                                                               与空白血清对照组比较，含药血清各剂量组、DAC
        火 30 s，68 ℃延伸 30 s，共 35 个循环；最后 68 ℃延伸
                                                           组细胞（上清液）中RORγt、IL-17蛋白表达水平均显著降
        5 min。PCR 反应结束后，产物上样于 2％琼脂糖凝胶，                     低（P＜0.05）。结果见图1、表2。
        在 120 V 电压下电泳 20 min，使用凝胶成像分析系统拍
        照成像，并采用 Image J 1.52 a 软件分析 DNA 电泳条带                 RORγt                                    58 kDa
        的灰度值，并计算RORγt基因启动子甲基化水平：RORγt
        基因启动子甲基化水平＝给药组条带灰度值/空白对照                            GAPDH                                     36 kDa
        组条带灰度值。实验重复3次。                                            空白血清对  含药血清低 含药血清中    含药血清高   DAC组
                                                                   照组     剂量组    剂量组     剂量组
        2.8  双荧光素酶法检测细胞中 RORγt 基因启动子转录
                                                                图1    各组细胞中RORγt蛋白表达的电泳图
        活性
            先将 RORγt 基因启动子片段克隆构建到 pGL3-Ba-                 3.4  含药血清对细胞中 RORγt 基因启动子甲基化的
        sic-luc 载体上，命名为 pGL3-RORγt-luc，经生工生物工              影响
        程（上海）股份有限公司测序正确后用于后续实验。将                               与空白血清对照组比较，含药血清中、高剂量组和
                                  5
        Th17 细胞按每孔 500 μL（1×10 个细胞）接种于 24 孔板               DAC 组细胞中 RORγt 基因启动子甲基化水平均显著升
        中，细胞分组同“2.3”项下。常规培养 24 h 后，每孔转染                    高（P＜0.05）。结果见图2、表3。
        0.5 μg pGL3-RORγt-luc及10 ng RL-TK质粒，6 h后更换
        为新鲜培养基，同时细胞给药处理同“2.3”项下。处理
        48 h后，按照双荧光素酶检测试剂盒说明书步骤检测细
        胞中RORγt基因启动子的转录活性。
        2.9 统计学方法
            使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行数据分析和作                                                            200 bp
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        图。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
                                                              M   U   M   U  M   U  M   U   M  U
        析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
                                                              空白血清对  含药血清低   含药血清中  含药血清高   DAC组  Marker
        3 结果                                                   照组     剂量组     剂量组    剂量组
                                                           图 2   各组细胞中 RORγt 基因启动子甲基化检测的电
        3.1 含药血清对Th17细胞增殖的影响
                                                                 泳图
            与空白血清对照组[（100.700±6.500）％]比较，含
        药 血 清 低 、中 、高 剂 量 组 和 DAC 组 细 胞 的 增 殖 率            3.5  含药血清对细胞中 RORγt 基因启动子转录活性的
        [ （88.040 ± 2.970）％ 、（75.182 ± 4.216）％ 、（58.440 ±  影响
        5.575）％、（58.440±5.575）％、（44.461±3.147）％，n＝             与空白血清对照组比较，含药血清各剂量组和DAC
        6] 均显著降低（P＜0.05），并且具有一定的剂量依赖                       组细胞中 RORγt 基因启动子的转录活性均显著降低
        趋势。                                                （P＜0.05），且具有一定的剂量依赖趋势。结果见表3。


        中国药房    2022年第33卷第15期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 15  ·1823 ·
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