Page 35 - 《中国药房》2022年15期
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formula can promote the methylation level of RORγt gene，and inhibit the expression of RORγt and the secretion of IL-17，so as to
        inhibit the proliferation of Th17 cells.
        KEYWORDS    scleroderma；Wenyang huazhuo tongluo formula；drug-contained serum；RORγt；methylation；Th17 cell

            硬皮病又名系统性硬化病，是以皮肤和内脏器官纤                         20180701，产地为山西）、山药（批号 180601，产地为河
        维化为主要特征的自身免疫性疾病，其发病机制主要包                           南）、淫羊藿（批号 181001，产地为四川）、熟地黄（批号
        括纤维化、免疫炎症、血管损伤等，而免疫系统失调特别                          180301，产地为河南）、桂枝（批号180901，产地为广西）、
        是辅助性 T 细胞 17（T helper lymphocytes 17，Th17）/调       积 雪 草（批 号 180804，产 地 为 云 南）、白 芥 子（批 号
        节性 T 细胞（T regulatory cell，Treg）失衡在硬皮病发病            180802，产地为河南）等饮片均购自河南省张仲景大药
        及病程进展中起着重要作用 。表观遗传学研究发现，                           房，经南阳理工学院张仲景国医国药学院张超云副教授
                                 [1]
        转录因子 RORγt（又名 RORC 或 RORC2）基因启动子低                  鉴 定 均 为 真 品 。 甲 基 化 转 移 酶 抑 制 剂 地 西 他 滨
        甲基化水平会导致维甲酸相关孤核受体（retinoic acid                    （decitabine，DCA）原料药（批号 S1200，纯度＞99.93％）
        related nuclear orphan receptor，RORγt）的高表达，进而促     购自美国 Selleck 公司；CCK-8 试剂盒（批号 C0038）、
        进Th17分化，如在硬皮病患者Th17细胞中就存在RORγt                     BCA 蛋白定量试剂盒（批号 P0012）购自上海碧云天生
        基因低甲基化、蛋白高表达的现象              [2－3] 。               物技术有限公司；双荧光素酶检测试剂盒（批号 E1960）
            中医学中无硬皮病这个病名，其应属皮痹等范畴。                         购自美国Promega公司；第一链cDNA合成试剂盒（批号
        本课题组前期突破硬皮病的传统治疗观点，率先提出                            K1622）、Lipofectamine TM  3000 转染试剂（批号1887047）
       “肺脾肾-皮毛”相关理论。结合硬皮病的临床表现，本                           购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；荧光定量 PCR
        课题组认为硬皮病病性属本虚标实——本虚是肺脾肾                            试剂 SYBR Green（批号 04913914001）购自德国 Roche
        三脏之阳气虚，标实是寒邪凝结、湿痰瘀等浊邪阻络，脉                          公司；DNA提取试剂盒（批号B618503）、DNA纯化试剂
        络不通；病位在络脉，与肺脾肾密切相关 。温阳化浊通                          盒（批号B610367）、琼脂糖（批号A600014）、UNlQ-10柱
                                          [4]
        络方是以黄芪桂枝五物汤、补肺汤、二仙汤等为基础创                           式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒（批号 B511321）均购自生
        制而成，由黄芪、党参、桂枝、淫羊藿、积雪草、白芥子等                         工生物工程（上海）股份有限公司；人 IL-17 酶联免疫吸
        10味药材组成。诸药相伍，通补并用，标本兼顾，具有补                         附测定（ELISA）试剂盒（批号E-EL-H0103c）购自武汉伊
        肺健脾益肾、化浊通络之效，共奏扶正祛邪之功，对硬皮                          莱瑞特生物科技股份有限公司；RORγt 兔多克隆抗体
                        [5]
        病具有良好的疗效 。本课题组前期研究表明，温阳化                           （批号 DF3196）购自江苏亲科生物研究中心有限公司；
        浊通络方能够调节硬皮病患者外周血 Th17/Treg 失衡，                     甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）鼠单克隆抗体（批号
        降低 Th17 细胞数量及白细胞介素 17（interleukin 17，              AC002）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；辣根过
        IL-17）水平，同时其还可通过下调微小核糖核酸-155、                      氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗
        IL-6及酪氨酸激酶2、信号转导和转录激活因子3等的表                        （批号 5220-0336）、HRP 标记的羊抗鼠 IgG 二抗（批号
        达，从而抑制 Th17 细胞增殖        [6－8] 。本研究拟在前期研究           074-1806）购自美国 KPL 公司；DNA 甲基化修饰试剂盒
        基础上，进一步采用血清药理学的方法，通过观察温阳                           （批号D5030）购自美国Zymo公司；热启动DNA聚合酶
        化浊通络方含药血清对Th17细胞增殖、RORγt mRNA及                     （批号 M0490S）购自美国 New England Biolabs 公司；其
        其蛋白表达、RORγt基因甲基化的影响，探讨其治疗硬皮                        余试剂均为分析纯，水为超纯水。
        病的作用机制，为温阳化浊通络方防治硬皮病提供理论                           1.3  动物
        参考。                                                    本研究所用动物为健康 SPF 级 Wistar 雌性大鼠，共
        1 材料                                               60 只，7～8 周龄，体质量为 220～250 g，购自北京维通
        1.1 主要仪器                                           利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为
            本研究所用的主要仪器包括ABI Veriti 96W型梯度                  SCXK（京）2016-0011。大鼠饲养于温度为（24±2）℃、
        聚合酶链式反应（PCR）仪、ABI ViiA7 型实时荧光定量                    相对湿度为（50±10）％、昼夜交替（12 h/12 h）的环境
        PCR 仪、NanoDrop 2000 型核酸蛋白浓度分析仪（美国                  中。饲养期间大鼠自由摄食、饮水。本研究动物实验经
        Thermo Fisher Scientific 公司），Synergy H1 型全功能酶      南阳理工学院伦理委员会审核批准，批准号为南理工动
        标仪（美国 BioTek 公司），GloMax 20/20 型发光检测仪               伦审〔2018〕011号。
       （美国Promega公司），Mini-PROTEAN 3型蛋白电泳仪、                 1.4 Th17细胞
                  +
        Gel Doc XR 型凝胶成像分析系统（美国Bio Rad公司），                     Th17 细胞来源于 2018 年 3 月－2019 年 7 月在南阳
        FACSCelesta型流式细胞仪（美国BD公司）。                         市中心医院确诊并接受治疗的硬皮病患者血液样本。
        1.2  主要药品与试剂                                       经患者知情同意后，抽取其外周血5 mL，由南阳理工学
            黄 芪（批 号 180830，产 地 为 山 西）、党 参（批 号              院张仲景国医国药学院韩立老师分选Th17细胞并通过


        中国药房    2022年第33卷第15期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 15  ·1821 ·
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