Page 53 - 《中国药房》2022年13期
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（20±2）℃、相对湿度 50％～70％、12 h 明暗交替环境                    血2～4 mL，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，留沉淀
        中，自由饮水、摄食，适应性喂养5 d后用于实验。                           的红细胞，再用生理盐水按上述方法洗涤 2～3 次，得压
        2 方法                                               积红细胞。取压积红细胞 1 mL，加冷双蒸水 1.5 mL，用
        2.1 茯苓多糖的制备                                        漩涡混匀器充分混匀1 min制得溶血液，置于－20 ℃冰
            茯苓丁粉碎后经80％乙醇回流提取2次（提取时间                        箱保存，用于检测 HbA1c 水平。用普通采血管取全血 5
        分别为2、1 h），滤过，取滤渣，挥干至无醇味后用氢氧化                       mL，以 3 000 r/min 离心10 min，小心吸取上清液即为血
        钠溶解，常温下充分搅拌后过滤。滤液用磷酸调至                             清，置于－80 ℃冰箱保存，用于检测血脂指标TG、TC水
        pH＝7，沉 淀 用 纯 水 洗 涤 数 次 ，滤 过 后 的 洗 涤 液 经            平和抗氧化指标 MDA、GSH-Px、SOD 水平。取肝脏组
        WTM-1812D型膜分离实验设备微滤、超滤后，与上述沉                       织约 100 mg 检测肝糖原含量。各指标检测操作均严格
        淀合并，冷冻干燥后得茯苓多糖。采用苯酚-硫酸法测                           按照相应试剂盒说明书进行。
        得茯苓多糖含量为95.60％。                                    2.7 肝脏和胰腺组织病理学观察
        2.2 分组、造模与给药                                           随机选择“2.5”项下每组 3 只大鼠的肝脏和胰腺组
            大鼠适应性喂养 5 d 后，禁食 4 h（每次禁食均换垫                   织，用 4％多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切
        料以避免垫料内遗漏有饲料，影响禁食效果），取大鼠尾                          片，HE 染色、二甲苯透明后，于光学显微镜下观察肝细
        尖静脉血，用530活力型手持血糖仪检测空腹血糖，作为                         胞情况和胰岛细胞变性坏死情况，并用显微镜照相系统
        大鼠基础血糖值。将大鼠按照禁食4 h后基础血糖水平                          拍照（每个样品随机选取3个区域），进行病理学等级评
        组间差异无统计学意义（P＞0.05）为标准，分为空白对                        分。其中肝脏病理等级评分采用Knodell组织学活动指
        照 组 、模 型 组 、二 甲 双 胍 组（阳 性 对 照 ，剂 量 为 200           数评分系统并参考文献[15]：Ⅰ级为界面性炎症及桥接
        mg/kg）和茯苓多糖低、中、高剂量组（剂量分别为 100、                     坏死的程度，按 0～4 分评定；Ⅱ级为小叶内肝细胞变性
        200、400 mg/kg），每组8只，各给药组的剂量依据来自前                   和坏死的范围及汇管区的炎症状况，按 0～4 分评定；Ⅲ
        期预实验。除空白对照组外，其余各组大鼠采用高脂饲                           级为纤维化程度，按0～4分评定。胰腺病理等级评分标
        料联合STZ诱导构建2型糖尿病大鼠模型：大鼠饲喂高                          准参考文献[16]：Ⅰ级为胰岛形态损坏的程度，按 0～4
        脂饲料，第 21 天时禁食不禁水 12 h，根据预实验结果腹                     分评定；Ⅱ级为胰岛细胞排列紊乱及细胞核游离的程
        腔注射 STZ 40 mg/kg；3 d 后检测造模大鼠空腹血糖值                  度，按 0～4 分评定；Ⅲ级为胰岛细胞数量减少及细胞坏
        均大于11.3 mmol/L，表明造模成功；继续饲喂高脂饲料                     死的程度，按0～4分评定。以上评分越接近0分代表病
        至第28天，巩固造模。造模同时，模型组和空白对照组                          理程度越轻，越接近4分代表病理程度越重。
        大鼠每日灌胃等体积水，各给药组大鼠每日灌胃相应剂                           2.8  肝脏组织 PI3K/Akt/FoxO1 通路相关蛋白表达水
        量的药物，每日1次，连续灌胃42 d。                                平检测
        2.3  日常状态观察及体质量检测                                      采用Western blot法检测。取“2.5”项下部分冻存肝
            实验期间观察大鼠的饮水量、尿量、饮食量、毛色、                        脏组织，加 RIPA 裂解液，冰浴彻底匀浆，将匀浆液转移
        精神状态等情况，并每日测定大鼠的体质量。                               至离心管中，振荡，冰浴 30 min，同时用移液器反复吹
        2.4  空腹血糖检测和口服葡萄糖耐量试验                              打，确保匀浆液完全裂解。以12 000 r/min于4 ℃离心5
            各组大鼠在给药前、给药后（给药结束前 1 d）检测                      min，收集上清液，即为总蛋白溶液。取部分总蛋白溶液
        空腹血糖。口服葡萄糖耐量试验：给药前1 d禁食4 h后                        用 BCA 试剂盒测定总蛋白含量，剩余部分沸水浴 5 min
        取大鼠尾尖静脉血，用 530 活力型手持血糖仪检测灌胃                        使蛋白变性，变性后置于－80 ℃冰箱保存，备用。取变
        葡萄糖前（0 h）的血糖；然后灌胃2.5 g/kg葡萄糖，分别在                   性蛋白40 μg，采用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
        灌胃0.5、2 h时检测血糖，计算口服葡萄糖耐量试验曲线                       胶电泳分离目的蛋白，其中分离胶电压 80 V，浓缩胶电
        下面积（area under curve，AUC）：AUC＝0.25×（血糖 0 h+        压 120 V；用 0.45 μm 的 PVDF 膜 300 mA 转膜 90 min，用
        4×血糖 0.5 h+3×血糖 2 h ）。AUC 越大说明 2 型糖尿病模型            牛 奶 封 闭 1 h，分 别 加 入 p-PI3K、p-AKT、p-FoxO1、
        大鼠对葡萄糖的代谢能力越弱，侧面反映糖尿病的病程。                          PEPCK、G6Pase 和 GAPDH 一抗（稀释度分别为 1 ∶ 500、
        2.5 脏器指数计算                                         1∶1 000、1∶500、1∶500、1∶2 000、1∶10 000），于4 ℃孵育过
            末次给药后，取大鼠腹部主动脉血，再解剖得大鼠                         夜；次日，用 TBST 漂洗 3 次，加入相应二抗（稀释度为
        心脏、肝脏、肾脏组织，用生理盐水清洗、滤纸擦拭、称定                         1 ∶ 10 000），于常温下继续孵育1 h后，用TBST漂洗3次，
        质量后，置于－80 ℃冰箱保存。脏器指数＝脏器质量/                         滴加新鲜配制的ECL混合溶液（鲁米诺与过氧化氢体积
        体质量×1 000。                                         比 1 ∶ 1 混合）至膜的蛋白面，暗室中曝光，根据不同的
        2.6  HbA1c、TG、TC、MDA、GSH-Px、SOD水平及肝糖               光强度调整曝光条件，显影、定影。将胶片进行扫描存
        原含量检测                                              档，采用 AlphaEase FC 软件处理系统导出目的蛋白和
                                                                            ®
            取“2.5”项下血样和肝脏组织。用肝素抗凝管取全                       内参 GAPDH 的灰度值，采用 Excel 软件计算，以目的蛋


        中国药房    2022年第33卷第13期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 13  ·1583 ·
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