Page 36 - 《中国药房》2022年13期
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SK-Hep-1 cells. CONCLUSIONS KA@HM-LPS is prepared successfully，which can effectively inhibit the migration and invasion
        of liver cancer cells with Legumain enzyme overexpression，and improve the blood compatibility of HM.
        KEYWORDS     harmine；mitochondria；Legumain enzyme；liposome

            肝癌严重影响着人类的生活，其中，我国肝癌的发                          雷磁创益仪器仪表有限公司），Nano ZS 型纳米粒径仪
        病例数占全球的 55％        [1－3] 。在肝癌的药物治疗方面，由             （英国 Malvern 公司），Modulyo 型真空冷冻干燥机、371
        于化疗药物的全身毒性或严重不良反应，导致患者生存                            型 CO2培养箱、Herasafe   TM  KS 型Ⅱ级生物安全柜（美国
                 [4]
        质量下降 。研究与开发安全高效的药物递送系统，有                            Thermo Fisher Scientific 公司），85-2 型恒温磁力搅拌器
        望降低化疗药物毒性反应的严重程度，同时维持或提高                           （常州金坛精达仪器制造有限公司），ZWYR-D2402型恒
        治疗效果。                                               温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），Victor Nivo
            去氢骆驼蓬碱（harmine，HM）是从骆驼蓬种子中分                     型多功能酶标仪（美国 PerkinElmer 公司），JEM-1230 型
        离出来的生物碱。研究显示，HM 通过抑制蛋白激酶 B                          透 射 电 镜 [JEOL 捷 欧 路（北 京）科 贸 有 限 公 司]，
        （protein kinase B，Akt）磷酸化诱导胶质母细胞瘤细胞凋                ECLIPSE Ti 型激光共聚焦显微镜[Nikon 仪器（上海）有
        亡，并通过 G2 细胞周期阻滞和线粒体途径诱导肝母细                          限公司]，SX-500型全自动高压灭菌锅（日本Tomy Digital
        胞瘤 HepG2 细胞凋亡      [5－6] 。然而，由于 HM 溶解度低且            Biology公司）。
        在大剂量下易引起神经毒性，导致其临床应用受限。线                            1.2 主要药品与试剂
        粒体是一种高度活跃的细胞器，通过不断分裂和融合来                                本研究的主要药品与试剂有HM标准品（成都瑞芬
        维持细胞的正常生理功能 。线粒体动力学失调通常会                            思生物科技有限公司，批号Q041-180308，高效液相色谱
                               [7]
        影响肿瘤细胞的能量供应、氧化还原信号和代谢功能。                            法测得含量＞98％），SPC[艾伟拓（上海）医药科技有限
        由于线粒体的功能障碍在肿瘤发展中起着至关重要的                             公司，批号 SY-SO-200401]，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-
        作用，已被确定为治疗肿瘤的关键靶点 。Legumain酶，                       聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000 ）、DPPC、Chol（西安瑞禧
                                         [8]
        又称天冬酰胺内肽酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族，最初                            生物科技有限公司，批号分别为 LP-R4-039、CC0657、
        发现于豆类植物 。研究表明，Legumain 酶在不同类型                       RA0200624），胎牛血清、青霉素、链霉素溶液、胰酶
                       [9]
        的实体肿瘤中表达上调，其水平与肿瘤的恶性潜能呈正                            MEM培养基（美国Gibco公司，批号分别为2173969RP、
        相关 。KA肽由Legumain酶响应氨基酸序列和线粒体                        2129299、2186962、8121247），磷酸盐缓冲液（PBS，美国
            [10]
        靶向肽 KLA 序列组成，其双级靶向特点有待进一步考                          Hyclone 公司，批号 AG29574691），Dil 细胞膜红色荧光
        察 [11－12] 。                                         探 针（ 上 海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司 ，批 号
            为提高HM进入肿瘤细胞及其线粒体的效率，降低                          010421210629），MitoLite Blue FX490 线粒体蓝色荧光
        HM 的毒副作用，本研究以大豆磷脂（soybean phospho-                  染料（美国AAT Bioquest公司，批号1771462），CCK-8试
        lipid，SPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoyl phosphati-         剂 盒（ 北 京 博 奥 森 生 物 技 术 有 限 公 司 ，批 号
        dylcholine，DPPC）、胆固醇（cholesterol，Chol），以及 KA        BA03175388），基质胶[康宁（上海）有限公司，批号
        肽偶联的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000                           1060001]，甲 醇（天 津 市 化 学 试 剂 有 限 公 司 ，批 号
        （DSPE-PEG2000-KA）为材料负载 HM，得到 Legumain 酶             20211101410），DSPE-PEG2000-KA（本实验室自制，批号
        和线粒体双级靶向 HM 脂质体（KA@HM-LPS），并对其                      20210828），其余试剂均为分析纯。
        制剂学特性、体外抗肿瘤作用及生物相容性进行初步评                            1.3  细胞与动物
        价，以期为后续研究提供实验基础。                                        人正常肝癌细胞SK-Hep-1购自武汉普诺赛生命科技
        1 材料                                                有限公司；Legumain 酶过表达的人肝癌细胞 SK-Hep-1
        1.1 主要仪器                                           （LGMN -SK-Hep-1）在本实验室通过慢病毒介导转染的
                                                                   +
                                                                    [13]
            本研究的主要仪器有 UV-2700 型紫外可见分光光                      方法获得 ；人正常肝细胞LO2由新疆医科大学药学院
        度计[岛津（上海）实验器材有限公司]，R-2003型旋转蒸                       艾尼娃尔·艾克木教授课题组赠送；雄性BALB/c裸鼠（8
        发仪、SHZ-95B 型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪                        周龄，22～24 g，生产许可证SCXK-2016-0006）购自北京
        器有限责任公司），HWS-24 型电子恒温水浴锅（上海一                        维通利华实验动物技术有限公司。
        恒科学仪器有限公司），KQ5200DE型超声清洗器（昆山                        2 方法与结果
        市超声仪器有限公司），BSA124S型电子分析天平（德国                        2.1 HM含量测定方法的建立
        Sartorius 公司），3-18KS 型台式高速冷冻离心机（美国                  2.1.1 HM 标准曲线的建立           精密称取 HM 标准品 10
        Sigma化学公司），VCX500型超声波破碎仪（美国Sonics                   mg，用甲醇溶解，并定容至 10 mL，制成质量浓度为 1
        公司），610000 型微型脂质体挤出器（美国 Avanti 公司，                  mg/mL的HM标准品贮备液。将其用甲醇稀释，制得质
        孔径为 100 nm 的聚碳酸酯膜），PHSJ-3F 型 pH 计（上海                量浓度为10 μg/mL的HM标准品溶液，置于紫外可见分


        ·1566 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 13                                 中国药房    2022年第33卷第13期
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