Page 40 - 《中国药房》2022年13期
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KA@HM-LPS，孵育 48 h。每个孔中加入 10 μL CCK-8                性摄取，并靶向至癌细胞的线粒体。结果见图6。
        孵育2 h，采用酶标仪在450 nm波长处测定A值，并根据                       2.9 KA@HM-LPS对肝癌细胞迁移和侵袭的影响
        公式⑤计算细胞存活率 。                                            肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤发生、发展、转移和
                            [24]
            数据分析和统计方法同“2.2.2”项下。结果显示，                       复发的重要原因 。本研究通过 Transwell 实验分别测
                                                                           [27]
              +
        LGMN -SK-Hep-1 的细胞存活率要显著低于 SK-Hep-1                 定 KA@HM-LPS 对 LGMN+-SK-Hep-1 细胞迁移和侵袭
                                               +
        （P＜0.001），表 明 KA@HM-LPS 对 LGMN -SK-Hep-1            的影响。
        细胞的抑制作用显著大于 SK-Hep-1 细胞，初步说明                        2.9.1  细胞迁移实验        将 LGMN -SK-Hep-1 细胞重悬
                                                                                         +
        KA@HM-LPS 具有显著的 Legumain 酶响应性。结果                    于无血清胰酶 MEM 培养基中，按照 1×10 个/孔接种至
                                                                                                4
        见图 5B。                                              Transwell小室。将细胞分为空白对照组（加入无血清胰
        2.8 Legumain 酶过表达对 KA@HM-LPS 线粒体靶向                  酶MEM培养基）、HM组、未修饰脂质体（HM-LPS）组和
        性的影响                                                KA@HM-LPS组，其中涉及HM的终浓度均为20 μmol/L
            由于HM无自发荧光特性，为观察KA@HM-LPS被                      （剂量依据来源于前期预实验）。下室加入 20％胎牛血
        KA肽介导细胞的摄取和定位情况，将HM替换成Dil细                          清 600 μL，在 5％CO2、37 ℃条件下培养 48 h。上室用
        胞膜红色荧光探针，采用与KA@HM-LPS相同的制备方                         PBS 洗 3 次，4％多聚甲醛固定 20 min，结晶紫染色 20
        法得到 Dil 负载的 KA 肽修饰脂质体（KA@Dil-LPS）。                  min，PBS洗3次，晾干，拍照 。Transwell实验图片分析
                                                                                    [28]
                             +
        取 SK-Hep-1 和 LGMN -SK-Hep-1 细 胞 ，分 别 接 种 到          应用 Image J 1.53 软件，实验数据分析和统计同“2.2.2”
                                                                                                +
        Confocal 皿中，每皿 1×10 个细胞，在 5％CO2、37 ℃条件              项下。结果显示，KA@HM-LPS对LGMN -SK-Hep-1细
                              4
        下培养 12 h。加入 KA@Dil-LPS 孵育 6 h，其中 Dil 的终             胞迁移的抑制作用显著高于HM-LPS（P＜0.001）。结果
                      [25]
        浓度为 2 μmol/L 。将细胞用预热的无血清胰酶 MEM                      见图 7、图 8A。这说明 KA@HM-LPS 可以更好地抑制
        培养基清洗 3 次，根据 MitoLite Blue FX490 线粒体蓝色              Legumain酶过表达癌细胞的迁移。
        荧光染料试剂盒检测结果标记各组细胞的线粒体，置于                            2.9.2  细胞侵袭实验        Transwell 上室先用 50 μL 基质
        共聚焦显微镜下观察 KA@HM-LPS 在 2 种细胞中的摄                      胶（V 基质胶 ∶ VPBS＝1 ∶ 8）铺胶，4 ℃过夜，再水化。后续实
                             [26]
        取情况与线粒体靶向性 。结果显示，在Legumain酶过                        验步骤同“细胞迁移实验”。结果显示，KA@HM-LPS
                                                                     +
        表达的 LGMN -SK-Hep-1 细胞中，KA@Dil-LPS 更多地               对 LGMN -SK-Hep-1 细胞侵袭的抑制作用显著高于
                     +
        被细胞摄取，且特异性地聚集在线粒体膜上和线粒体                             HM-LPS（P＜0.001），结 果 见 图 8B、图 9。 这 说 明
        内，这说明 KA@HM-LPS 具有 Legumain 酶响应性线粒                  KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain酶过表达癌细
        体靶向特点，其可以被Legumain酶过表达的癌细胞特异                        胞的侵袭。









                  SK-Hep-1细胞












             LGMN -SK-Hep-1细胞
                 +






                                     线粒体                    KA@Dil-LPS                 重合
                                         图6    线粒体靶向性细胞摄取实验结果


        ·1570 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 13                                 中国药房    2022年第33卷第13期
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