Page 72 - 《中国药房》2022年9期
P. 72
制备匀浆液，按照试剂盒说明书步骤操作测定细胞中 表1 qRT-PCR引物序列及扩增产物大小
AST、ALT 水平。实验重复3次。 基因名称 引物序列 扩增产物大小/bp
2.5 细胞培养液中GSH、SOD、MDA水平检测 GRP-78 上游引物：5′-TGGCTGGAAAGCCACCAAGA-3′ 127
下游引物：5′-CTTCACCAGTTGGGGGAGGG-3′
5
取对数生长期的L02细胞，按照4×10 个/孔接种于6
PERK 上游引物：5′-AGGTGACTGTGGAGGACGCT-3′ 299
孔板中，常规培养24 h后，按“2.4”项下方法分组、给药和 下游引物：5′-ACGGTCTTGGTCCCACTGGA-3′
培养，每组设置3个复孔。加入相应培养液/药液常规培 β-actin 上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′ 250
养48 h后，收集各组细胞，按照相应试剂盒方法操作后， 下游引物：5′-TGCCAGGGCAGTGATCTCCT-3′
采用酶标仪检测细胞培养液中 GSH、SOD、MDA 水平。 孔。加入相应培养液/药液常规培养 48 h 后，吸弃培养
实验重复3次。 液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞 3 遍，加入细胞裂解液
2.6 细胞中ROS水平检测 （RIPA-PMSF体积比100 ∶ 1）进行细胞裂解，收集各组细
采用流式细胞术进行检测。取对数生长期的 L02 胞的总蛋白，采用 BCA 法测定细胞中总蛋白浓度。取
细胞，按照 4×10 个/孔接种于 6 孔板中，常规培养 24 h 10 μL蛋白样品上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶电
5
后，按“2.4”项下方法分组、给药、培养，每组设置 3 个复 压 80 V，电泳时间30 min；分离胶电压 100 V，电泳时间
孔。加入相应培养液/药液常规培养48 h后，收集各组细 60 min）分离，然后电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上
胞，按照试剂盒说明书方法操作后，采用 Flowjo10.4 软 （电流 350 mA，转膜时间 90 min），将 PVDF 膜置于 5％
件分析细胞中 ROS水平。实验重复3次。 脱脂奶粉中封闭2 h；加入一抗（GRP-78一抗的稀释比例
2.7 线粒体膜电位检测 为1 ∶ 5 000，PERK一抗的稀释比例为1 ∶ 1 000，β-actin一
采用JC-1法进行检测。取对数生长期的L02细胞， 抗的稀释比例为 1 ∶ 30 000），4 ℃孵育过夜；用 TBST
按照 4×10 个/孔接种于 6 孔板中，常规培养 24 h 后，按 洗涤 5 次、每次 5 min，加入稀释后二抗（稀释比例均为
5
“2.4”项下方法分组、给药、培养，每组设置3个复孔。加 1 ∶ 1 000），常温孵育 1 h；TBST 洗膜 5 次、每次 5 min，加
入相应培养液/药液常规培养培养 48 h 后，弃去旧培养 入 ECL 发光液，使用化学发光成像仪进行成像。应用
基，用磷酸盐缓冲液清洗细胞3 次，加入100 μL培养液， Image J 1.8.0 软件进行灰度值分析，以目的蛋白条带灰
然后再加入100 μL JC-1染色工作液（10 μg/mL），避光孵 度值与内参（β-actin）蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋
育30 min。孵育结束后吸弃上清液，加入磷酸盐缓冲液 白的表达水平。实验重复3次。
洗涤细胞 2 次，加入培养液，荧光显微镜下观察细胞中 2.10 统计学方法
JC-1聚合体与JC-1单体的荧光情况（当线粒体膜电位较 使用 SPSS 21.0 软件对实验数据进行统计分析，使
高时，JC-1大多聚集在线粒体的基质中，形成聚合体，发 用 GraphPad Prism 8.0 软件作图。计量数据以 x±s 表
出红色荧光；而当线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集 示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
在线粒体的基质中，此时 JC-1 为单体，发出绿色荧光）， 用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
并采用Image J 1.8.0软件分析红色荧光强度值和绿色荧 3 结果
光强度值。以红色荧光强度与绿色荧光强度的比值表 3.1 细胞活力测定结果
示线粒体膜电位变化水平，比值越低表示膜电位越低。 补骨脂刺激 L02 细胞 48 h 后，其对细胞的 IC50 为
实验重复3次。 1 203 μg/mL，故本研究选择补骨脂 1 200 μg/mL 作为造
2.8 细胞中GRP-78、PERK mRNA表达水平检测 模质量浓度。五味子刺激 L02 细胞 48 h 后，其对细胞
采用 qRT-PCR 法进行检测。取对数生长期的 L02 的 IC50为 3 348 μg/mL，故本研究选择 600、1 200、2 400
细胞，按照 4×10 个/孔接种于 6 孔板中，常规培养 24 h μg/mL 作为五味子的配伍浓度与补骨脂联用进行后续
5
后，按“2.4”项下方法分组、给药、培养，每组设置 3 个复 研究。
孔。加入相应培养液/药液培养48 h后，收集各组细胞， 3.2 细胞中AST、ALT 水平测定结果
提取细胞中总RNA；测定总RNA浓度和纯度后，逆转录 与空白对照组比较，补骨脂模型组细胞中 AST、
为 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。扩增程序 ALT水平显著升高（P＜0.01）；与补骨脂模型组比较，补
为：50 ℃热启动10 min，95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s， 骨脂-五味子低、中、高剂量组细胞中 AST、ALT 水平均
57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用2 －ΔΔCt 显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表2。
法计算各组细胞中GRP-78、PERK mRNA表达水平。实 3.3 细胞培养液中GSH、SOD、MDA水平测定结果
验重复3次。引物序列由湖南艾科瑞生物工程有限公司 与空白对照组比较，补骨脂模型组细胞培养液中
合成，待测基因的引物序列及扩增产物大小见表1。 GSH、SOD水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01），MDA水
2.9 细胞中GRP-78、PERK蛋白表达水平检测 平显著升高（P＜0.05）；与补骨脂模型组比较，补骨脂-五
采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的 味子低、中、高剂量组细胞培养液中GSH、SOD水平均显
L02细胞，按照4×10 个/孔接种于6孔板中，常规培养24 h 著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），MDA 水平均显著降低
5
后，按“2.4”项下方法分组、给药、培养，每组设置 3 个复 （P＜0.05或P＜0.01）。结果见表3。
·1090 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 9 中国药房 2022年第33卷第9期
