Page 71 - 《中国药房》2022年9期
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chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，是临床上广泛              S0033S）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白
                      [5]
        应用的保肝中药 。研究发现，五味子与补骨脂配伍可                           G（IgG）（H+L）二抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG
                              [6]
        减轻补骨脂引起的肝损伤 。                                      （H+L）二抗均购自上海碧云天生物技术有限公司；其余
            毒理学研究表明，内质网应激和氧化应激是补骨脂                         试剂均为实验室常用规格，水为超纯水。
        诱导肝损伤的重要机制          [7－10] 。其中，内质网应激是通过            1.3 细胞株
        影响活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性来激活                人正常肝细胞株 L02 购自北纳创联生物技术有限
        氧化应激反应：ROS 活性升高会消耗细胞内的抗氧化                          公司。
        物质谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶                    2 方法
       （superoxide dismutase，SOD），引起细胞内丙二醛（malon-          2.1 细胞培养
        dialdehyde，MDA）含量增加，致使线粒体膜电位下降、天                       将L02细胞培养于含10％胎牛血清、100 U/mL青霉
        冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨          素、100 U/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37 ℃、
        酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）释放过度，进           5％CO2、饱和湿度下培养。当细胞培养至 80％融合时，
        一步加剧线粒体功能障碍，最终发生氧化损伤 。除此                           用胰酶常规消化，取对数生长期的细胞进行实验。
                                                [11]
        之外，氧化应激也可通过内质网中未折叠和折叠错误的                           2.2 药物的提取及配制
        蛋白质过度积累，激活内质网应激，导致内质网应激相                               取补骨脂饮片、五味子饮片各100 g，分别加入10倍
        关标志物葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated protein           量水（1 000 mL）浸泡30 min，然后再以100 ℃煎煮3 次、
        78，GRP-78）和蛋白激酶 R 样内质网激酶（protein kinase            每次 1 h，过滤，合并 3 次滤液，加热浓缩，制成生药质量
        R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）的 表 达 升   浓度均为 1 g/mL的浓缩液。将浓缩液在4 ℃下以5 000
          [12]
        高 。鉴于此，本研究拟通过体外培养L02肝细胞，从氧                         r/min 离心 10 min，取上清液，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤；
        化应激和内质网应激两个角度探讨五味子与补骨脂配                            收集滤液，分装保存于－20 ℃环境下，实验时用含10％
        伍后减轻补骨脂对L02肝细胞损伤的作用机制，为补骨                          胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释至需要的质量浓度。
        脂-五味子配伍减毒的临床应用提供参考。                                2.3  细胞活力检测
        1 材料                                                   采用MTT法进行检测。取对数生长期的L02细胞，
                                                                    3
        1.1  主要仪器                                          按照8×10 个/孔接种于96孔板中，常规培养24 h。将细
            本研究所用的主要仪器包括CKX41SF型倒置荧光                       胞分为不同质量浓度补骨脂组[0（空白对照）、375、750、
        显微镜（日本Olympus公司），Cytation 5型细胞成像酶标                 1 500、3 000 μg/mL，质量浓度参考前期预实验结果设置]
        仪（美国 Bio Tek 公司），5424R 型高速低温离心机（德国                 和不同质量浓度五味子组[0（空白对照）、500、1 000、
        Eppendorf 公司），HF90 型 CO2培养箱（力康生物医疗科                2 000、4 000、8 000 μg/mL，质量浓度参考前期预实验结
        技控股有限公司），Luna-Ⅱ型自动细胞计数仪（韩国                         果设置]，每组设置 3 个复孔。加入相应培养液/药液常
        Logos Biosystems 公司），Nano Drop One 型超微量分光          规培养48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），37 ℃
        光度计、QuantStudio 5型高分辨实时荧光定量聚合酶链                    孵育4 h。吸弃含 MTT 的培养液，每孔加入150 μL的二
        式反应（qRT-PCR）仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公        甲基亚砜，轻微振荡 10 min，使结晶充分溶解。采用酶
        司），GE Amersham Imager 600 型多色荧光成像系统（美              标仪于 490 nm波长处检测各组细胞的光密度（OD）值，
        国General Electric公司）。                              计算细胞存活率[细胞存活率（％）＝给药孔 OD490/空白
        1.2  主要药品与试剂                                       对照孔 OD490×100％]，并采用改良寇氏法计算药物的半
            补骨脂饮片（批号 2006001）、五味子饮片（批号                     数抑制浓度（IC50 ）。实验重复3次。
        200301）购自山东中医药大学附属医院中药房，由山东                        2.4 细胞中AST、ALT水平检测
        中医药大学附属医院中药临床药学研究室张学顺主任                                采用微板法进行测定。取对数生长期的L02细胞，
        药师鉴定分别为豆科植物补骨脂 P. coryfolia L.和木兰                  按照 4×10 个/孔接种于 6 孔板中，常规培养 24 h。弃去
                                                                    5
        科植物五味子 S. chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果            旧培养基，将细胞分为空白对照组（含 10％胎牛血清的
        实。MTT 粉末、GSH 检测试剂盒（批号 BC1175）均购自                   RPMI-1640 培养基）、补骨脂模型组（1 200 μg/mL 补骨
        北京索莱宝科技有限公司；重组 Anti-GRP-78 抗体、重                    脂，质量浓度参照“2.3”项下实验结果设置）、补骨脂-五
        组Anti-PERK抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；                      味子低、中、高剂量组（1 200 μg/mL 补骨脂分别联用
        β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自美国Proteintech公司；AST             600、1 200、2 400 μg/mL 五味子，质量浓度参照“2.3”项
        检测试剂盒（批号 C010-2-1）、ALT 检测试剂盒（批号                    下实验结果设置），每组设置 3 个复孔。加入相应培养
        C009-2-1）均购自南京建成生物工程研究所；SOD 检测                     液/药液常规培养 48 h，收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液
        试剂盒（批号AK060）、MDA检测试剂盒（批号AK288）、                    清洗1～2 遍后，以1 000 r/min离心10 min，弃上清；细胞
        JC-1 线粒体膜电位荧光探针（批号 D-9113）均购自北京                    沉淀中加入匀浆介质，在冰浴条件下超声（功率300 W，
        博奥森生物技术有限公司；ROS 检测试剂盒（批号                           频率 40 kHz；每超声 3～5 s、间隔 30 s，重复 5 次）破碎，


        中国药房    2022年第33卷第9期                                              China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 9  ·1089 ·
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