Page 66 - 《中国药房》2022年9期

细胞接种于 6 孔板中，每孔含 1×10 个细胞，每组设 3 个 G0～G1期 1 200
6
1 600 G0～G1期
复孔。将细胞按照“2.2”项下方法分组并给药，培养24 h， 1 000
收集细胞，以预冷磷酸盐缓冲液洗涤后重悬细胞，采用 1 400 800
细胞凋亡检测试剂盒中的Annexin Ⅴ-FITC 标记，避光、 细胞数量 800 细胞数量 600
室温孵育15 min，以PI染色后上机检测细胞凋亡率。 400 G2～M期 400 G2～M期
2.7 细胞中自噬与凋亡相关蛋白表达水平检测 S期 200 S期
0 0
采用Western blot法检测。将对数生长期的HCCLM3 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
通道（FL2-A）
细胞接种于 6 孔板中，每孔含 1×10 个细胞，每组设 3 个 通道（FL2-A） B. GLA 2.5 μg/mL组
6
A.对照组
复孔。将细胞按照“2.2”项下方法分组并给药，培养24 h， G0～G1期 G2～M期
提取细胞总蛋白并以 BCA 法测定蛋白浓度后，取蛋 600 G2～M期 600 G0～G1期
白适量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 500 500
电泳结束后依次转膜，封闭，加入 Bax、Bcl-2、cleaved 细胞数量 400 细胞数量 400
300
300
caspase-3、Beclin1、β-actin 一抗（稀释度均为 1 ∶ 1 000）， 200 200 S期
S期
4 ℃摇床孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀 100 100
释度为1∶3 000），室温摇床孵育1 h；洗膜后曝光，在化学 0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
发光成像系统中成像、扫描。以目的蛋白与β-actin蛋白 通道（FL2-A） 通道（FL2-A）
C. GLA 5 μg/mL组 D. GLA 10 μg/mL组
条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。
图1 各组HCCLM3细胞周期分布图
2.8 细胞中Bcl-2与Beclin1的结合与解离状态检测
采用免疫共沉淀法检测。将对数生长期的HCCLM3 表 1 各组 HCCLM3 细胞的不同细胞周期占比检测结
细胞接种于 10 cm 细胞培养皿中，每皿含 5×10 个细胞， 果（x±±s，n＝3，％％）
6
每组设3个复皿。按照“2.2”项下方法分组并给药，培养 组别 G0～G1期 S期 G2～M期
24 h，收集细胞，提取细胞总蛋白，以BCA法测定蛋白浓 对照组 56.153±0.798 24.187±0.496 19.660±0.305
GLA 2.5 μg/mL组 48.960±0.243 24.213±0.248 26.827±0.445
度。取2组蛋白样品分装于IgG阴性对照管、检测管中。
GLA 5 μg/mL组 39.143±0.385 a 22.063±0.266 38.794±0.206 a
IgG 阴性对照管中加入 IgG 抗体，用于消除非特异性蛋 GLA 10 μg/mL组 30.337±0.280 a 20.090±0.159 49.573±0.439 a
白的影响，作为阴性对照；检测管中加入 Bcl-2 抗体，用 a：与对照组比较，P＜0.01
于收集与Bcl-2结合的Beclin1蛋白。将上述阴性对照管
粒体膜电位降低，尤以 GLA 10 μg/mL 组下降更为显著
和检测管于4 ℃摇床孵育过夜，每管加入琼脂糖凝珠，筛
（P＜0.01）。结果见图2。
选出与Bcl-2结合的Beclin1蛋白，变性处理后以 Western
3.3 GLA对HCCLM3细胞线粒体形态和自噬的影响
blot法检测Bcl-2与Beclin1结合的蛋白表达情况。
透射电镜观察结果显示，GLA 5 μg/mL 组细胞线粒
2.9 统计学分析
体高度肿胀，嵴模糊不清甚至消失，出现较多自噬小体；
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料
对照组细胞线粒体形态无异常。结果见图3。
以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步
3.4 GLA对HCCLM3细胞凋亡的影响
两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
3 结果 流式细胞术检测结果显示，对照组、GLA 2.5 μg/mL
组、GLA 5 μg/mL 组、GLA 10 μg/mL 组的细胞凋亡率分
3.1 GLA对HCCLM3细胞周期阻滞的影响
别为（3.277±0.415）％、（4.087±0.945）％、（17.625±
流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，GLA 5
μg/mL 组、GLA 10 μg/mL 组 HCCLM3 细胞周期显著阻 1.433）％、（74.673±3.402）％。与对照组比较，GLA 2.5
滞于 G2～M 期，差异均有统计学意义（P＜0.01），尤以 μg/mL 组细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），GLA
GLA 10 μg/mL组作用更为明显；而GLA 2.5 μg/mL组的 5 μg/mL组、GLA 10 μg/mL 组均显示出显著的促凋亡作
细胞周期阻滞作用差异无统计学意义（P＞0.05）。结果 用（P＜0.01），且 GLA 10 μg/mL 组促凋亡作用更明显。
见图1、表1。 结果见图4。
3.2 GLA对HCCLM3细胞线粒体膜电位的影响 3.5 GLA 对 HCCLM3 细胞中 Bax、Bcl-2、cleaved cas-
细胞线粒体膜电位结果显示，对照组、GLA 2.5 μg/mL pase-3、Beclin1蛋白表达的影响
组、GLA 5 μg/mL 组、GLA 10 μg/mL 组细胞中红绿荧光 Western blot法检测结果显示，GLA 5 μg/mL组、GLA
强度比值分别为 1.712±0.335、1.673±0.297、0.541± 10 μ g/mL 组 HCCLM3 细 胞 中 Bax、cleaved caspase-3、
0.134、0.117±0.041。与对照组比较，GLA 5 μg/mL 组、 Beclin1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白
GLA 10 μg/mL 组细胞红绿荧光强度比值降低，提示线 表达水平均显著降低（P＜0.01）。结果见图5。

·1084 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 9 中国药房 2022年第33卷第9期