Page 79 - 《中国药房》2022年8期
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胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是指机体对胰岛            司 ；DMEM 高 糖 培 养 基 、胎 牛 血 清（批 号 分 别 为
        素生物反应性降低的一种现象，表现为胰岛素促进葡萄                           20181112、20181121）均购自美国 Gibco 公司；盐酸二甲
        糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素                           双胍肠溶片（批号20181114，规格0.5 g）购自贵州圣济堂
        而产生高胰岛素血症 。IR是代谢综合征、2型糖尿病、                         制药有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，
                          [1]
        高血压、心脑血管疾病等多种疾病的发病基础，严重威                           PBS）、0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediamine
                    [2]
        胁人类的健康 。IR 的患病率正在增加，尤其是在发展                         tetraacetic acid，EDTA）消化液、青链霉素混合液、四甲基
                                              [3]
        中国家的年轻人口中，患病率达 20％～40％ 。中医药                        偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚
        在改善IR方面具有效果显著、成本低、不良反应少等优                          砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、10×TBST 缓冲液（批号
                                                  [4]
        势，探究中药对IR的作用是当前研究的热点之一 。据                          分 别 为 20181129、20181212、20181030、20181025、
        最新报道显示，近5年来发现的具有IR改善作用的中药                          20181220、20181201）均购自北京索莱宝科技有限公司；
        活性成分有35种，其中黄酮类成分有11种，约占三分之                         BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂
        一。鬼针草总黄酮（total flavonoids of Bidens polisa L.，     盒、Western 一抗稀释液、Western 二抗稀释液（批号分别
        以下简称“TFB”）是其中的主要代表成分 。TFB 具有                       为 20181127、20181124、P0256、P0258）均购自上海碧云
                                            [4]
                                            [5]
        抗炎、抗氧化、抗肝纤维化等多种药理作用 。有研究指                          天 生 物 技 术 有 限 公 司 ；葡 萄 糖 测 定 试 剂 盒（批 号
        出，c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号        20180205）购自上海荣盛生物药业股份有限公司；兔源
                                          [6]
        通路在 IR 的发生发展中具有重要作用 。黄酮类化合                         JNK 单克隆抗体、兔源胰岛素受体底物 1（insulin recep-
        物在改善IR方面具有明显的作用，且这种作用可能与调                          tor substrate-1，IRS-1）单克隆抗体（批号分别为 9252、
                           [7]
        控 JNK 信号通路有关 。虽然已有报道指出，TFB 可以                      2382）均购自美国Cell Signaling Tchnology公司；兔源蛋
        通过调控磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1/                         白 激 酶 C（protein kinase C，PKC）多 克 隆 抗 体（批 号
        葡萄糖转运蛋白 4（phosphoinositide 3-kinase/serine-thre-   ab182126）购自英国 Abcam 公司；小鼠源β-肌动蛋白
        onine protein kinase 1/glucose transporter protein 4，PI3K/  （β-actin）单克隆抗体（批号 10021293）购自武汉三鹰生
        AKT1/GLUT4）信号通路中转录因子编码基因及蛋白的                       物技术有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxi-
                                      [8]
        表达来改善 HepG2 细胞的 IR 状态 ，但有关 TFB 对 IR                dase，HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（immunoglo-
        及JNK相关信号通路的作用尚待进一步的探究。为此，                          bulin G，IgG）二抗（批号BST16K26C16L54）购自武汉博
        本研究拟复制 HepG2 细胞 IR 模型并结合分子对接实                      士德生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯，水为去
        验，探讨TFB改善IR的可能作用机制，为研发改善IR作                        离子水。
        用的潜在活性药物提供依据。                                      1.3  细胞株
        1 材料                                                   人肝癌 HepG2 细胞购自中国科学院上海细胞生物
        1.1  主要仪器                                          研究所。
            本研究所用主要仪器有 SpectraMax Plus 384 型酶              2 方法
        标仪（香港分子仪器公司），ZF-2 型三用紫外分析仪（上                       2.1  TFB的制备及纯度测定
        海市安亭电子仪器厂），Odyssey型红外荧光扫描成像系                           参考杜利月等 、瞿慧等 的研究方法并进行改良：
                                                                            [9]
                                                                                    [10]
        统（美国 LI-COR 公司），PowerPac Basic 电泳系统（美国             取鬼针草药材适量，用 10 倍量的 80％乙醇加热回流提
        Bio-Rad公司），3111型二氧化碳（CO2 ）细胞培养箱（美国                 取2次，每次2 h，合并提取液；将提取液过滤、合并、浓缩
        Thermo Fisher Scientific 公司），SHA-CA 型恒温水浴锅         至无醇味，加适量热水，超声促溶，冷却后抽滤，得滤
       （常州易晨仪器制造有限公司），1334 型无菌操作台（长                        液。滤液经预处理好的HPD-100大孔吸附树脂吸附24 h
        沙米淇仪器设备有限公司）等。                                     后，先以 2 倍柱体积的水洗去杂质，再用 3 倍柱体积的
        1.2 主要药品与试剂                                        70％乙醇进行洗脱并收集洗脱液，浓缩至无乙醇味，冷
            鬼针草药材（批号 20190604）购自钦州医药有限责                    冻干燥后即得TFB样品（每1 kg鬼针草药材得TFB样品
        任公司，经钦州市第二人民医院赵一宇副主任中医师鉴                           54 g），采用紫外分析仪于 510 nm 波长处测得其纯度为
        定为菊科鬼针草属植物鬼针草B. polisa L.的地上部分。                    52.72％（以芦丁计）。
            芦丁对照品（批号 100080-201711，纯度≥98％）购                2.2 TFB和PA对HepG2细胞增殖影响的检测
        自中国食品药品检定研究院；HPD-100 大孔吸附树脂                            将对数生长期的 HepG2 细胞，按 5×10 个/mL 接种
                                                                                                4
       （粒度 16～60 目，批号 20180424）购自天津市海光化工                   于96孔培养板中，每孔100 μL，设置实验组、对照组、空
        有 限 公 司 ；棕 榈 酸（palmic acid，PA）对 照 品（批 号            白组。实验组加入不同质量浓度的 TFB[5、10、20、40、
        P104234，纯度≥99％）购自阿拉丁试剂（上海）有限公                      80、160 mg/L，以含10％胎牛血清和1％青链霉素混合液


        中国药房    2022年第33卷第8期                                               China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 8  ·969 ·
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