Page 80 - 《中国药房》2022年8期
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的完全培养基（后同）配制，浓度参考预实验结果设置]，                          与上样缓冲液按体积比1∶3混合后，放入沸水中煮5 min
        对照组加入含 0.5％DMSO 的完全培养基，空白组加入                        使变性。取变性蛋白 100 μg，上样到 10％SDS-PAGE 凝
        不含细胞、不含药物的完全培养基，每孔加入量均为                             胶上进行电泳，电泳后转移至PVDF膜，用TBST缓冲液
        100 μL，每组设置 6 个复孔。于 37 ℃、5％CO2条件（后                  封闭，在4 ℃下与IRS-1、PKC、JNK、β-actin一抗（稀释比
        同）下培养24 h后，每孔加入5 mg/L的MTT溶液10 μL，继                  例均为 1 ∶ 1 000）孵育过夜，用 TBST 缓冲液洗涤 3 次，
        续培养2～4 h后，吸弃上层液，每孔加入DMSO 150 μL，                    滴加 HRP 标记的 IgG 二抗（稀释比例为 1 ∶ 1 000）避光
        振荡脱色10 min，用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的                      孵育 1 h，再次用 TBST 缓冲液洗涤后，使用红外荧光扫
        光密度（optical density，OD）并计算各组细胞存活率：细胞                描成像系统显影，通过 Image J v1.8.0 软件分析，以目标
        存活率（％）＝（OD 实验组－OD 空白组）/（OD 对照组－OD 空白组）×             蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值的比值来表示其表
        100％。上述步骤均需避光操作。                                    达量。
            取对数生长期的 HepG2 细胞，检测 PA 对 HepG2 细                2.6 分子对接实验
        胞增殖的影响，PA 浓度分别为 50、75、100、125、150、                      根 据 朱 冬 春 等    [11]  的 研 究 以 及 TCMSP 数 据 库
        175、200 μmol/L（以完全培养基为溶剂，浓度参考预实验                   （https：//tcmspw.com），检索到槲皮素（quercetin）、槲皮苷
        结果设置），每组设置3个复孔，作用时间设为24 h和48 h，                    （quercitrin）、异槲皮苷（isoquercitrin）、金丝桃苷（hypero-
        其余设置与操作同前。
                                                            side）、芦丁（rutin）、木犀草素（luteolin）、奥卡宁（okanin）、
        2.3 HepG2细胞IR模型的建立
                                                            海生菊苷（maritimetin）共 8 个 TFB 的主要活性成分，利
            取对数生长期的 HepG2 细胞，按 1×10 个/mL 接种
                                             5
                                                            用 PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）
        于96孔培养板中，每孔100 μL，分为对照组和模型组，每
                                                            下载上述成分的三维结构，基于OpenBabel 2.4.1软件，在
        组设置3个复孔。待细胞贴壁后，对照组加入完全培养
                                                            MMFF94力场下对成分结构进行优化。从RCSB Protein
        基，模型组加入新配制的含 PA 50、75、100、125、150、
                                                            Data Bank 数 据 库（http：//www.rcsb.org/）下 载 IRS-1
        175、200 μmol/L的完全培养基（浓度参考预实验结果设
                                                           （PDB ID：1K3A）、JNK（PDB ID：3V6R）、PKC（PDB ID：
        置），培养24 h或48 h后，吸弃原有培养基，PBS清洗2次
                                                            2UZP）蛋白晶体的三维结构，使用 AutoDockTools 1.5.6
        后，换上无酚红的 DMEM 高糖培养基，培养 24 h 后，以
                                                            软件进行可旋转键的搜寻与定义，并对蛋白结构进行除
        酶标仪检测培养基上清液中的葡萄糖含量并计算葡萄
                                                            去水分子、添加氢原子、添加电荷等处理，以 PDBQT 格
        糖消耗量，选择最优的PA浓度和作用时间，以复制PA诱
                                                            式保存。利用 AutoDock Vina 1.1.2 分子对接软件，根据
        导的HepG2细胞IR模型。严格按照试剂盒说明书操作。
                                                            蛋白配体的位置，确定蛋白活性位点的坐标，其余参数
        2.4  TFB 对 HepG2 细胞 IR 模型葡萄糖消耗量影响的
                                                            均采用默认值，选取对接结合能量最低的构象用于分子
        检测
                                                            对接结合模式分析，获取每个成分的分子对接能量打分
            实验设正常组，模型组，TFB 低、中、高质量浓度组
                                                            值（其绝对值越高，表明对接结构越紧密且稳定） ，并
                                                                                                       [12]
        （20、40、80 mg/L，浓度参考“2.2”项下结果设置），每组设
                                                            使用 Discovery Studio 2016 分子模拟软件的“可视化功
        置 3 个复孔。培养 24 h，除正常组外，其余各组参照
                                                            能”对分子对接结构进行可视化展示。
       “2.3”项下最优实验方法，使用 PA 诱导 HepG2 细胞复制
                                                            2.7  统计学分析
        IR模型。继续培养24 h后，以酶标仪检测葡萄糖含量并
                                                                采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
        计算葡萄糖消耗量。严格按照试剂盒说明书操作。
        2.5 TFB 对 HepG2 细胞 IR 模型中 IRS-1、PKC、JNK             料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两
        蛋白表达影响的检测                                           比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
            采用 Western blot 法检测。实验设正常组，模型组，                 3 结果
        TFB 低、中、高质量浓度组（20、40、80 mg/L，浓度参考                   3.1 TFB对HepG2细胞增殖的影响
       “2.2”项下结果设置）以及二甲双胍阳性对照组（1 mmol/L，                        与对照组比较，5～80 mg/L的TFB对HepG2细胞的
        浓度参考文献[8]设置），每组设置 3 个复孔。培养 24 h                     存活率没有显著影响（P＞0.05），但 160 mg/L 的 TFB 可
        后，除正常组外，其余各组参照“2.3”项下最优实验方法，                        显著降低细胞的存活率（P＜0.05），如图 1 所示。因此，
        使用 PA 诱导 HepG2 细胞复制 IR 模型。继续培养 24 h，                以20、40、80 mg/L作为TFB的低、中、高质量浓度进行后
        吸弃各组培养液，细胞用 PBS 清洗 1 次，加入 RIPA 裂                    续研究。
        解液 150～250 μL，于冰上裂解 20～30 min，于 4 ℃下                3.2 PA对HepG2细胞增殖的影响
        以 12 000 r/min离心20 min，吸取上清液，用BCA蛋白浓                    与对照组比较，经50、75、100 μmol/L的PA作用24 h
        度测定试剂盒进行蛋白含量测定。将各组样本的蛋白                             后，细胞的存活率均无明显变化（P＞0.05）；经125、150、


        ·970 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 8                                    中国药房    2022年第33卷第8期
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